基于小尺度高原鼢鼠種群遺傳結構研究

劉麗，王貴珍，周延山，楚彬，馬素潔，姬程鵬，田永亮，花立民

(甘肅農業大學草業學院，教育部草業生態系統重點實驗室，甘肅農業大學-新西蘭梅西大學草地多樣性研究中心，甘肅 蘭州 730070)

青藏高原是我國以及東亞氣候系統穩定的重要屏障，有豐富多樣、獨具特色的特殊生態系統類型和珍稀動植物種類，是全球生物多樣性保護的重點區域[1]。廣布于該區的高寒草甸在畜牧業生產和水源涵養等生態保育功能中發揮著極其重要的作用[2]。然而隨著氣候變化、人類干擾等因素，高寒草甸生態系統退化嚴重，其中草原鼠害是加劇退化的重要因素[3]。高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)是青藏高原高寒草甸生態系統優勢地下害鼠，當其種群密度超過環境容量時，顯著影響到草地生產力和植物群落結構[4]。但是，高原鼢鼠是土壤疏松、生物多樣性維持的關鍵物種之一，有著 “生態系統工程師”的美譽[5-6]。

種群遺傳分化研究是遺傳資源利用和物種保護的基礎[7]。遺傳多樣性是決定一個物種進化潛力和抵御不良環境能力的主要驅動力[8-9]。高原鼢鼠依靠挖掘地下洞道系統完成取食、擴散等行為[10]。穩定的地下生活環境和有限的遷移能力使不同地理種群間存在嚴重的限制性基因流[11]和獨特的地域種群遺傳結構[12]。蔡振媛等[12]通過測定線粒體控制區序列變異發現地理屏障與高原鼢鼠種群間遺傳距離沒有顯著相關性，種群間遺傳分化中大約79.6%的變異可以由地理隔離解釋。但這些研究多集中在較大尺度的地理區域和歷史事件對其種群結構的影響[11-12]，小尺度特殊地理環境等對鼢鼠種群遺傳結構影響的研究較少。研究尺度的差異會對遺傳結構結果解釋各異，而小尺度上的種群遺傳結構則受到棲息地景觀模式、個體永久性遷移頻率及由于交配事件導致的基因擴散情況等多重因素的影響[13]。為進一步研究小尺度生境中環境因素對種群遺傳的影響，本試驗采用微衛星標記的方法，在祁連山東段高寒草甸區小尺度下，研究不同地理位置的高原鼢鼠種群遺傳結構特點、基因交流及其影響因素，為該物種生物多樣性保護和草原鼠害防治提供相關參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地選在甘肅省天祝縣抓喜秀龍鄉高寒草甸區。該區位于東祁連山的天祝金強河河谷，地理坐標為北緯37°11′，東經102°29′，海拔 2710～3080 m。境內地形受馬牙雪山和雷公山隆起的影響，形成東西向的峽谷地帶，西高東低。氣候寒冷潮濕，太陽輻射強。年均溫-0.1 ℃，>0 ℃年積溫1380 ℃；年降水量416 mm，多為地形雨，集中于 7、8、9 三個月。無絕對無霜期，僅分冷熱兩季。天然草地主要為高寒草甸。主要植物有垂穗披堿草(Elymusdahuricus)、矮嵩草(Kobresiahumilis)、線葉嵩草(K.capillifolia)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、秦艽(Gentianamacrophylla)、扁蓿豆(Ruthenianmedic)、早熟禾(Poaannua)、狗娃花(Heteropappushispidus)、黃芪(Astragalusmembranaceus)、棘豆(Oxytropisbella)、蕨麻(Potentillaanserina)、苔草(Carexhumilis)等。

1.2 試驗材料

試驗材料總共包括163個高原鼢鼠個體，試驗采樣點分別在甘肅祁連山東段高寒草甸區的馬營灘(MYT)、下南泥溝(XNG)、馬營河東(MYR)和馬營河西(MYL)共4個樣地，如圖1所示。MYT、XNG、MYL和MYR 的樣地面積分別為7.50，1.60，1.25，1.25 hm2。其中，MYT樣地中高原鼢鼠的個體采樣點的最遠直線距離為600 m，采樣點范圍約3 hm2；XNG樣地中采樣點的最遠直線距離為500 m，采樣點范圍約1 hm2；MYL樣地中采樣點的最遠直線距離為200 m，采樣點范圍約1 hm2；MYR樣地采樣點的最遠直線距離為300 m，采樣點范圍約1.2 hm2。4個樣地共采集鼢鼠的雌性個體數量為87；雄性個體數量為76。采取典型種群隨機抽樣法，分別在2014、2015年的5、6、8月用弓箭捕獲鼢鼠，記錄鼢鼠的性別、年齡后解剖獲取部分肝臟組織，置于1.5 mL離心管中，先保存于液氮罐中，在實驗室內轉入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3 DNA提取及微衛星擴增

鼢鼠肝臟組織的總DNA用上海生工生物技術有限公司提供的試劑盒(Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，批號：12111677ZS)提取。操作過程中，將蛋白酶K的用量由原來的20 μL增加為40 μL，其他步驟不變。將提取好的DNA保存于-20 ℃的冰箱用于后續試驗。

試驗中SSR擴增用10個核苷酸微衛星位點的引物(ECTI5、ECTI6、ECTI8、ECTI10、ECTI21、ECTI22、ECTI23、ECTI33、 ECTI48、ECTI49)[14]，這些位點在高原鼢鼠種群中具有多態性，可用于種群位點擴增。PCR擴增用熒光標記的引物，分別用HEX(綠光)、FAM(藍光)和TAM(黃色)熒光基團在5′端標記合成熒光引物。

擴增體系為25 μL：其中包括1 μL的模板，上下游引物各0.5 μL，dNTP 10 mmol/L 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，Taq 酶0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。用GeneAmp的PCR擴增系統9700，反應循環包括95 ℃下3 min的預變性(聚合酶激活)；接著是10個循環95 ℃ 下30 s的變性；在60 ℃下退火30 s，在72 ℃延伸30 s；20個循環在95 ℃ 下變性30 s， 在55 ℃退火30 s，在72 ℃延伸30 s；最終72 ℃溫度下再修復延伸6 min。PCR銀光標記產物用毛細管電泳裝置ABIPRISM3130XL的Gene Scan 500 LIZ分析計算擴增片段的大小。試驗中引物擴增以及微衛星擴增反應委托上海生工生物工程有限公司完成。

圖1 高原鼢鼠采樣點地理分布Fig.1 Geographic distribution of plateau zokor sampling sites along the study area MYT,MYL, MYR, XNG, 分別代馬營灘、馬營河西邊、馬營河東邊、下南泥溝種群。下同。MYT, MYL, MYR, XNG, replace Mayingtan, the west and east side of Maying river, Xianannigou population. The same below.

1.4 統計分析

微衛星屬共顯性遺傳，通過STR分型實驗得到每一擴增片段的具體大小。使用Popgene(Version 1.3)軟件GenAlex 6.4統計微衛星基因座的等位基因數(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、遺傳相似系數(genetic similarity index,I)、種群間遺傳距離(genetic distance,Ds)、種群間近交系數(FST)、基因流(Nm)等遺傳分化系數及卡方檢驗種群哈迪溫伯格平衡[15-17]。參照Botstein等[18]的方法計算多態信息含量(polymorphism information content,PIC)。利用 Structure和Distruct軟件對等位基因數據進行遺傳結構推導分析，確定種群類聚數K值[13]等。用Excel整理制作相關圖、表。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性

來自祁連山東段高寒草甸區4個采樣點的163個高原鼢鼠DNA樣品，在10個微衛星位點上進行基因分型，4個種群共獲得164個等位基因(Na)，有效等位基因(Ne)為83.6。MYT、MYL、MYR、XNG種群的平均有效等位基因分別為1.79，1.66，2.17，2.75，平均觀測雜合度(Ho)分別為0.32，0.15，0.23，0.24，平均期望雜合度(He)分別為0.42，0.31，0.42，0.50，平均多態信息含量(PIC)分別為0.35，0.34，0.47，0.43。處于中等多態性水平(表1)。

表1 高原鼢鼠4個地理種群在10個微衛星基因座的多樣性指數Table 1 The genetic diversity indices of 10 microsatellite loci for four plateau zokor populations

Ne:有效等位基因數；He:期望雜合度；Ho:表觀雜合度；PIC:多態信息含量； -：無效數值。

Ne: Number of effective alleles;He: Expected heterozygosity;Ho: Observed heterozygosity;PIC: Polymorphism information content; -: Behalf invalid value.

2.2 種群哈迪溫伯格平衡檢驗(卡方檢驗 )

基于最小Pearsonχ2估計的哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)檢驗精確P值的無偏估測對各種群的多基因座檢測(multi-locus test)發現，4個種群在10個位點上大多處于極顯著不平衡狀態(P<0.001)。MYT種群的位點ECTI16、ECTI48和ECTI49、MYL和MYR種群的位點ECTI48、XNG種群的位點ECTI8和ECTI21處于遺傳平衡狀態(P>0.05)。種群MYL的ECTI8 和ECTI22位點處的基因型單一(表2)。種群偏離哈迪溫伯格平衡，表明高原鼢鼠種群間自由交流具有一定的局限性，或近親交配現象嚴重。

表2 種群哈迪溫伯格平衡檢驗(卡方檢驗 )Table 2 Hardy-Weinberg equilibrium testing (chi-square test) of plateau zokor populations

ns,無差異顯著性(P>0.05), **差異極顯著(P<0.01),***差異極顯著(P<0.001), -,單型。

ns mean no significant difference,P>0.05, ** mean very significant difference,P<0.01, *** mean extremely significant differences,P<0.001, -, monomorphic.

2.3 遺傳結構分析

圖2 用Structure推導的4個高原鼢鼠種群遺傳結構(K=2, 3, 4, 5)Fig.2 Structure analysis of 4 plateau zokor populations (K=2, 3, 4, 5)

依據貝葉斯群聚方法[19]，利用Structure和Distruct軟件[20]對研究的4個鼢鼠種群10個微衛星座位等位基因數據進行遺傳結構推導分析。結果如圖2所示，分別為當遺傳聚類種群數K=2, 3, 4, 5時的遺傳結構圖。根據K值對后驗概率自然對數lnP(D)[21]所做的曲線圖(圖3)表明，在K=2時，lnP(D)的值最大，隨后數值都較小。分析各種群的遺傳結構可知，本研究中 4個高原鼢鼠種群被分為 2個分類簇，分別用紅、綠兩種顏色表示，如圖2所示。即當K=2時，4個種群被分成2組：MYT種群為一組，MYL、MYR、XNG種群聚在一起為一組。

同時參照 Evanno 等[22]的方法利用 Structure 軟件對來自 4個不同高原鼢鼠種群進行貝葉斯聚類分析，聚類分類從K=1 到K=5，每個K重復運行 10 次，每次進行了 1000000 次馬爾科夫鏈蒙特卡羅重復搜索(MCMC)，舍棄最初的 50000 次。根據 ΔK方法(基于K的似然函數變動率)計算最大可能性的K值，結果為K=2(圖4)。這一結果與根據K值對后驗概率自然對數lnP(D)做曲線所得結果一致。

圖3 后驗概率自然對數[ln P(D)]與遺傳聚類種群數(K)的關系Fig.3 Relationship of ln probability data [ln P(D)] and population clusters (K)

圖4 利用 Evanno K 方法繪制不同種群分類簇K值變動Fig.4 The number of genetic clusters (K) by Delta K for different populations

用GenAlEx軟件進行高原鼢鼠居群4個不同區域163個個體基于10對SSR引物的遺傳距離的主坐標分析(PCoA)，前2個極軸坐標(Coordinate)分別解釋了高原鼢鼠種群整體遺傳變異的47.58%和8.20%。從圖 5 中可看到位于MYT樣地的個體聚為一組，而XNG、MYL、MYR三個樣地的個體傾向于聚為一組。得到類似的遺傳結構。

圖5 基于遺傳距離的主坐標分析(PCoA)Fig.5 Principal coordinate plot of genetic distance(PCoA)

2.4 種群遺傳分化的因素分析

以不同種群間的遺傳結構分析結果為基礎，結合近交系數(FST)與基因流(Nm)分析這4個不同地理種群間的遺傳分化情況。種群間無遺傳分化的標準值為FST=0～0.05[23]，阻止種群間遺傳分化的基因流值標準是Nm>1。如表3所示，4個不同地理種群兩兩之間的FST值都大于0.05，種群間的基因流值都小于1。種群XNG和MYR之間的基因流最大(0.616)，MYT和MYL之間的基因流最小(0.040)。XNG樣地與MYR、MYL樣地間的地理距離相當，但MYR和MYL樣地間存在天然河流，XNG與MYR間的遺傳分化程度(0.061)小于XNG與 MYL間的(0.120)；并且河流兩側樣地MYR與MYL、MYT與MYL間遺傳分化程度分別為0.130、0.470。XNG與MYT樣地間存在公路，XNG與MYT 間的遺傳分化程度(0.339)大于XNG與 MYR間的(0.061)。綜上所述，天然河流和公路可能對種群擴散有一定的阻礙作用，特殊棲息地環境影響種群與其他種群間的信息交流。

表3 4個高原鼢鼠種群的遺傳分化程度(FST，右上角)和基因流(Nm，左下角)Table 3 Fixation index resulting from comparing subpopulations to the total population (FST, above the diagonal) and gene flow (Nm, below the diagonal) populations

3 討論與結論

遺傳多樣性是生物固有的特性，是生物長期適應與進化的產物。每一生物的遺傳多樣性越豐富，對環境變化的適應能力就越強，就越容易擴展其分布范圍和開拓新的環境[24]。等位基因數是種群遺傳多樣性分析的重要參數之一[25]，本研究中高原鼢鼠種群共獲得164個等位基因，有效等位基因為83.6。種群平均多態信息含量(PIC)為0.40，遺傳多態性處于中等水平，與蘇軍虎[26]的研究結果一致。棲息地破碎化及嚴重的近親繁殖，阻礙種群間基因流動，是物種遺傳多樣性水平降低主要原因。高原鼢鼠有獨特的生活方式，主要依靠挖掘地下洞道系統完成活動、取食、擴散等行為。高耗能的挖掘行為嚴重制約其長距離的遷移擴散活動，使擴散率低于地上活動的動物[27]。低的遷移能力使種群間的基因流受到限制，增加種群內部近親繁殖的可能，最終使種群遺傳多樣性降低，產生明顯的種群遺傳結構模式[28-30]。

對種群遺傳研究發現種群的遺傳隔離會有潛在的種的分化，嚴重的限制性基因流會導致種群分化[31]。高原鼢鼠種群進行遺傳結構推導分析中，在K=2時，lnP(D)和ΔK的值都最大，4個種群被分成2組：MYT種群為一組，MYL、MYR和XNG種群聚在一起為一組。4個種群兩兩之間的FST值都大于0.05。種群MYT和MYL之間的遺傳分化程度較高(0.770)，并且種群之間較小的基因流值(小于1)不能阻止其分化。種群遺傳學認為空間距離、地理障礙等通常是阻礙基因交流、導致分化的重要因素[32]。XNG與MYR間的遺傳分化程度(0.061)小于XNG與MYL間的(0.120)，并且種群XNG和MYR之間的基因流(0.616)大于XNG和MYL之間的(0.313)。MYL和MYR之間的距離不到200 m，中間有河流隔離。XNG與MYT 間的遺傳分化程度(0.339)大于XNG與MYR間的(0.061)，XNG與MYT樣地間存在公路。表明在試驗范圍內特殊島狀棲息地限制了高原鼢鼠種群基因流，河流和公路對種群內和種群間個體交流可能有阻礙作用。蔡振媛等[12]研究發現種群間遺傳分化中大約79.6%的變異可以由地理隔離解釋。唐利洲等[11]研究結果表明高原鼢鼠不同地理種群間存在嚴重限制性基因流。國外其他地下嚙齒動物的研究結果表明地理距離是造成種群遺傳分化的主要原因[33]，并且在整個種群擴散過程中河流、裂谷、火山對其有阻礙作用[34-36]。除了MYL種群，MYT種群的多態信息含量、等位基因數、期望雜合度都比其他2個種群的要低。島狀地理環境限制該種群與外界的交流，增加種群內部的個體交流的機會，長久積累不利于增加種群遺傳多樣性，進而減弱對環境變化的適應能力[37]。

從遺傳學的角度分析高原鼢鼠遺傳多樣性、遺傳結構特征及影響因素，種群遺傳多樣性處于中等水平，河流和公路對種群基因交流可能有阻礙作用。對高原鼢鼠來說，長期的特殊生存環境對整個種群的遺傳特征有較大影響，不利于適應新的棲息環境。高原鼢鼠作為草原害鼠，嚴重破壞草地植被，控制其種群數量是草原保護工作的主要內容之一。由于高原鼢鼠對新環境的適應能力較差，可通過改變其棲息地環境達到減少種群數量的目的，有利于草地生態系統健康持續發展。

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