角質(zhì)形成細胞異常誘發(fā)銀屑病：基因工程動物模型的啟示

鄭海豪 石臻睿 王亮春

510120廣州，中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科

銀屑病的發(fā)病機制目前尚未完全闡明［1］。30年來，學術界一直對角質(zhì)形成細胞和免疫細胞的功能異常在銀屑病發(fā)病中孰為因果存在爭論［2］。起初認為銀屑病是由于角質(zhì)形成細胞異常增殖引起的，但隨著研究的深入，在皮損區(qū)發(fā)現(xiàn)Th1和Th17細胞浸潤，遂將注意力轉(zhuǎn)向T細胞介導的免疫反應，并逐漸將其作為銀屑病發(fā)病機制的核心［1］。近年來，基因工程銀屑病動物模型研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細胞在銀屑病皮膚炎癥的啟動和維持中均發(fā)揮關鍵作用。根據(jù)基因工程技術的特點，銀屑病小鼠模型主要分為條件性基因敲除和先天性基因表達異常小鼠模型。前者是在小鼠成年以后，通過注射枸櫞酸他莫昔芬特異性敲除角質(zhì)形成細胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)而誘發(fā)銀屑病，更接近于人類銀屑病的發(fā)生過程。后者是通過特異性細胞內(nèi)基因敲除或插入技術，使小鼠出生時即有角質(zhì)形成細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達增多或缺失，更接近于先天性疾病的發(fā)病模式。本文簡述幾種銀屑病基因工程動物模型以及相關研究，并結(jié)合近年我們團隊取得的一些研究成果，分析并深入理解角質(zhì)形成細胞在銀屑病發(fā)病機制中的作用。

一、（Krt1?5cre/ERT）1lpc X Junbtm3WagX Juntm4Wag小鼠

該小鼠的特點是在成年小鼠的任何周齡，通過腹腔或靜脈注射枸櫞酸他莫昔芬，特異性、選擇性敲除角質(zhì)形成細胞內(nèi)的JunB/c?Jun基因。基因敲除8～10 d后，小鼠即自發(fā)出現(xiàn)銀屑病樣皮炎和關節(jié)炎。皮損組織病理表現(xiàn)為表皮增生，中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，并伴有多種銀屑病相關細胞因子和趨化因子表達上調(diào)［3］。進一步將JunB/c?Jun雙敲小鼠與 Rag2?/?小鼠雜交，獲得具有免疫缺陷的 JunB/c?Jun/Rag2?/?小鼠（基因雙敲與T、B淋巴細胞缺乏），小鼠仍然出現(xiàn)銀屑病樣皮炎，充分說明角質(zhì)形成細胞異常足以誘發(fā)銀屑病［3］。與皮損發(fā)生不同，關節(jié)炎的發(fā)生卻要依賴于T淋巴細胞和腫瘤壞死因子（TNF）信號通路［3］。

該銀屑病模型的局限性在于JunB的表達具有異質(zhì)性。早期研究發(fā)現(xiàn)，JunB在銀屑病患者皮損中的表達顯著降低，而作為JunB的拮抗劑，c?Jun表達較正常皮膚顯著升高［3］。但是隨著研究深入，卻發(fā)現(xiàn)無論在銀屑病皮損區(qū)、還是非皮損區(qū)，JunB表達都呈現(xiàn)很大個體差異［4］，甚至還有研究發(fā)現(xiàn)其在尋常性銀屑病皮疹中表達上調(diào)［5?6］。這些研究結(jié)果提示，可能只有部分銀屑病的發(fā)生與JunB/c?Jun易感基因異常有關。另外，由于皮疹發(fā)生不依賴于T淋巴細胞，所以該小鼠模型自2005年建立以來并沒有得到廣泛應用。

二、Krt14?cre/ERT X Galectin?3FL/FL小鼠

這是我們實驗室尚在研究中的小鼠模型，其基因工程原理同上文小鼠，選擇性敲除角質(zhì)形成細胞內(nèi)的半乳糖凝集素3（galectin?3）。我們研究發(fā)現(xiàn)［7］，galectin?3在銀屑病表皮中顯著降低，而在其他銀屑病樣皮炎包括神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹、脂溢性皮炎、毛發(fā)紅糠疹、玫瑰糠疹、副銀屑病、扁平苔蘚的表皮中仍有豐富表達，提示表皮galectin?3的下降具有疾病特異性。將galectin?3敲除鼠尾部皮膚移植至野生型小鼠背部，12周以后移植皮膚出現(xiàn)銀屑病樣皮炎改變，提示表皮內(nèi)galectin?3蛋白缺失足以誘發(fā)銀屑病。為進一步研究galectin?3在銀屑病發(fā)病機制中的作用，我們建立了Krt14?cre/ERT X Galectin?3FL/FL小鼠模型，在成年小鼠選擇性敲除表皮內(nèi)galectin?3，基因敲除后第8周，部分小鼠出現(xiàn)皮膚異常。應用該動物模型，可進一步研究小鼠galectin?3缺失誘發(fā)銀屑病的機制，是否跟前期的體外實驗一樣，是通過MAPKs通路中的JNK，而不是的ERK和p38 MAPK信號途徑，并不依賴核因子（NF）κB調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的增殖分化，最終誘發(fā)銀屑病。

三、K5.STAT3C小鼠

K5.STAT3C小鼠以表皮持續(xù)過表達活化的信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）3為特點，出生后2周即可自發(fā)或在局部刺激下（表皮磨削、外用咪喹莫特）誘發(fā)銀屑病樣皮炎改變，但不會出現(xiàn)關節(jié)炎或其他關節(jié)異常。皮膚組織病理表現(xiàn)為角化不全、顆粒層消失和棘層肥厚，毛細血管擴張和白細胞浸潤。將該小鼠的皮膚移植至無胸腺小鼠（T淋巴細胞缺乏），單純外傷刺激后移植皮膚不會出現(xiàn)銀屑病樣改變，但皮內(nèi)注射活化的T淋巴細胞后，可誘發(fā)銀屑病樣皮炎。這些研究結(jié)果提示，STAT3可能通過調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞與T細胞間相互作用而促進銀屑病發(fā)生［8］。

STAT3是Janus激酶信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus?activatedkinasesignaltransducersandactivators of transcription，JAK?STAT）信號通路上的關鍵因子。磷酸化STAT3從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞核，與不同的啟動子序列結(jié)合后，調(diào)節(jié)細胞生長、分化及凋亡［9］。銀屑病皮損中，角質(zhì)形成細胞STAT3表達豐富，細胞核內(nèi)可以檢測到大量磷酸化STAT3蛋白。而健康人和其他炎癥性皮膚病，如慢性皮炎、癢疹、扁平苔蘚，表皮中僅有少量STAT3表達，核內(nèi)幾乎檢測不到磷酸化STAT3，提示STAT3在銀屑病角質(zhì)形成細胞功能異常中發(fā)揮重要作用［8］。

隨著對JAK?STAT信號通路研究的不斷深入，結(jié)合T淋巴細胞在K5.STAT3C小鼠疾病發(fā)生中的必要性，該小鼠模型逐漸成為研究免疫炎癥因子在銀屑病發(fā)病機制中作用的主要動物模型之一，并由此發(fā)現(xiàn)一些新的治療方向。例如，外用STAT3抑制劑STA?21，不僅能抑制K5.STAT3C銀屑病樣皮炎的發(fā)生，對銀屑病患者也有治療作用［10?11］。另外，外用TNF?α轉(zhuǎn)化酶抑制劑［11］或組織蛋白酶K抑制劑（NC?2300）均能顯著改善K5.STAT3C小鼠的銀屑病樣皮炎［12］。在該模型中關鍵的致病性細胞因子是IL?23，而非IL?22，也從側(cè)面解釋了抗IL?22抗體治療銀屑病臨床試驗失敗的原因［13］。將K5.STAT3C與自身免疫性關節(jié)炎的模型小鼠F759雜交，成功獲得銀屑病關節(jié)炎小鼠模型［14］。

四、K14?cre/Ikk2FL/FL小鼠

是另一種與信號途徑有關的基因工程銀屑病小鼠模型，該小鼠自出生起，表皮內(nèi)I?κB激酶（IKK）即被定向敲除。IKK可通過促進I?κB磷酸化而抑制NF?κB的功能，從而在多種炎癥過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。K14?cre/Ikk2FL/FL小鼠在生長過程中出現(xiàn)銀屑病樣皮炎改變，該病理現(xiàn)象的發(fā)生不依賴于T淋巴細胞、粒細胞和IFN信號通路，而依賴于巨噬細胞和TNF信號通路［15?16］。但因該模型小鼠多在幼年死亡，皮損處角質(zhì)形成細胞過度凋亡，組織病理與銀屑病相去甚遠，以及皮損發(fā)生不依賴于T淋巴細胞而未得到廣泛應用。

五、其他生長因子、細胞因子相關基因工程小鼠模型

血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）相關模型：K14?VEGF小鼠，在棘層肥厚的部位可以看到角化過度、角化不全和表皮角延長；血管迂曲、延長，幾乎和銀屑病患者無差別；并有T淋巴細胞浸潤，浸潤的CD4/CD8T細胞比例與銀屑病患者相似。VEGF抑制劑治療有效［17］。血管生成素受體相關模型：K5?Tie2小鼠，臨床和組織病理表現(xiàn)與K14?VEGF小鼠類似［18］。以上2個模型的局限性在于，臨床表現(xiàn)以血管異常為基礎，浸潤細胞主要為肥大細胞［19?20］。轉(zhuǎn)化生長因子β1相關模型：K5.TGFb1w小鼠，表現(xiàn)為棘層肥厚，突出的特征是小鼠出現(xiàn)Koebner征，但是皮膚炎癥不明顯［20?21］。角質(zhì)形成細胞生長因子相關模型：K15/KGF小鼠，局限性在于小鼠有免疫應答缺陷，并且毛囊生長受抑制［21?22］。細胞因子相關模型：K5?IL?17C、Il1rn（?/?）等。①K5?IL?17C小鼠，表現(xiàn)為角化不全，顆粒層消失，棘層肥厚，真皮毛細血管增生，炎癥細胞浸潤，突出特點是銀屑病相關的炎癥因子表達顯著上調(diào)，包括白細胞介素（IL）17A、IL?23、IL?12和S100A8等［23］；②Il1rn（?/?）小鼠，是IL?1受體拮抗劑敲除小鼠，表現(xiàn)為表皮肥厚、角化不全和表皮微膿腫，典型表現(xiàn)為鏡下可見的真皮內(nèi)小血管增生［24］。這些銀屑病小鼠模型更適合研究特定細胞因子或生長因子在銀屑病發(fā)病機制中的作用。

綜上所述，通過基因工程技術，特異性敲除或過表達角質(zhì)形成細胞內(nèi)的一些信號通路蛋白或細胞因子，確實可以誘發(fā)銀屑病樣皮炎，證明角質(zhì)形成細胞缺陷足以誘發(fā)銀屑病。但無論是接近于銀屑病發(fā)病模式的條件性基因敲除小鼠，還是類似于先天性疾病發(fā)病模式的角質(zhì)形成細胞基因表達缺陷小鼠，都不能完全模仿人類銀屑病發(fā)生的病理生理過程。首先，靶基因不具有銀屑病疾病特異性；其次，靶基因缺陷誘發(fā)的銀屑病樣皮炎只是部分類似人類銀屑病組織病理的改變（棘層肥厚、真皮乳頭毛細血管迂曲擴張、真皮內(nèi)炎癥細胞浸潤）；最后，相較于人類銀屑病，這些小鼠模型不具有免疫細胞和炎癥因子的系統(tǒng)性改變。所以，上述動物模型的研究結(jié)果尚不能說明角質(zhì)形成細胞和免疫細胞在銀屑病發(fā)病機制中的因果關系。期待隨著基因工程技術的進步，新的銀屑病動物模型能夠克服上述缺陷，更貼近于人類銀屑病的發(fā)生，為深入研究銀屑病的發(fā)病機制以及新藥研發(fā)提供更好的研究平臺。