CRISPR/Cas9在相關皮膚病及基因治療中的研究進展

支大龍 王剛

710032西安，第四軍醫大學西京皮膚醫院

近年來，隨著生物技術突破性的變革以及科學家們的不斷探索，新技術不斷涌現，推動著基因編輯的發展。傳統的基因組編輯技術是以同源重組為基礎對基因進行修飾，但由于構建復雜、效率低，使其應用受限。尋找新型、簡易、高效的基因組編輯技術成為當今生命科學研究的新熱點。人工核酸酶介導的基因組編輯技術通常是指利用人工核酸酶靶位點特異性形成DNA雙鏈斷裂，引起DNA的修復機制，從而達到基因修飾的目的，主要有以下3種：鋅指核酸酶、類轉錄激活因子核酸酶及成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。與傳統的基因組編輯技術不同，人工核酸酶技術是利用限制性內切酶對目的基因進行切割，導致DNA雙鏈斷裂，誘導其產生修復機制，從而實現基因組的定點編輯。

CRISPR/CRISPR相關蛋白（Cas）9系統是第3代基因編輯技術，相較于其他基因組編輯技術，CRISPR/Cas9系統構建簡易，耗時短，切割效率更高，且適用于多基因同時編輯。該技術憑借其獨特優勢，在一系列基因治療領域展現出極大的應用前景，如艾滋病、腫瘤、杜氏肌營養不良癥等多種疾病。CRISPR/Cas9系統最初在原核生物中發現，參與免疫抵御，使宿主獲得抵抗噬菌體、質粒等外源物質入侵的免疫能力。從Mali等［1］首次利用該系統實現基因組的編輯至今，其在包括斑馬魚［2］、大鼠［3］、小鼠［4］、非人靈長類［5］等許多物種中實現基因組的靶向編輯，很大程度上推動了生命科學和醫學的研究進程。本文主要綜述CRISPR/Cas9系統的研究歷史、主要構成、作用機制及其在基因治療中的應用等。

一、CRISPR/Cas9系統的研究歷史、結構基礎及作用機制

1.研究歷史：1987年，Ishino等［6］首次發現，在大腸桿菌基因組中存在一連串短的空間間隔重復序列，這一發現在當時并沒有引起科研工作者的足夠關注。2000年，Mojica等［7］將此類成簇的規律間隔的短回文重復序列稱為成簇的重復元件，進一步研究發現，該元件存在于40%的細菌和90%的古細菌中。2002 年，Coffey 和 Ross［8］將其正式命名為CRISPR。2005年，Mojica等［9］發現，在重復序列附近存在許多Cas的保守基因，并根據Cas基因不同將CRISPR系統分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。2013 年，Mali等［1］利用CRISPR/Cas9系統對小鼠基因組進行編輯，自此，CRISPR/Cas9開始作為一種新的基因組編輯技術。在基因功能、基因治療以及構建疾病動物模型等相關生命科學和醫學領域被廣泛使用。

2.結構基礎：CRISPR/Cas系統由多個重復序列（repeats）與非重復間隔序列（spacers）構成的R?S結構及編碼Cas的基因操縱子組成，其中R?S結構能夠特異性識別外源性DNA，并由類似于啟動子的CRISPR前導序列起始轉錄生成CRISPR RNA前體。Cas基因家族負責編碼具有多種功能的CRISPR相關蛋白，成熟CRISPR RNA由轉錄形成的CRISPR RNA前體與相關Cas蛋白的作用產生，并與tracrRNA協同作用，共同構筑細菌的免疫屏障。2011年，Wiedenheft等［10］將CRISPR/Cas9系統CRISPR RNA與反式激活crRNA的二聚體結構簡化為單鏈向導RNA與Cas9蛋白結合形成復合體，介導Cas9蛋白與目的基因結合并切割。

3.作用機制：CRISPR/Cas9系統作用機制分為3個階段，即獲取CRISPR間隔序列、轉錄CRISPR RNA前體和加工CRISPR RNA、CRISPR RNA與反式激活crRNA及Cas9蛋白結合成復合體對外源性DNA進行切割，導致DNA雙鏈斷裂。此外，原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif）也是CRISPR/Cas9系統的重要部分，為CRISPR基因座中一段高度保守序列（5′?NGG?3′）。 CRISPR/Cas9系統切割DNA后會使其雙鏈斷裂，引起DNA修復機制，實現基因編輯。DNA雙鏈斷裂會發生兩種修復模式：外源同源重組模板不存在時，細胞內發生非同源末端連接修復插入或缺失，導致移碼突變；外源同源重組模板存在時，可能會在細胞內發生同源重組修復。

二、CRISPR/Cas9系統在基因治療中的應用

基因治療指利用基因組編輯技術將致病基因糾正為正常基因，從而實現疾病的治療。傳統的基因治療難以將致病基因精準替換為正常基因，且可能會在生物體內殘留外源物質，對機體產生不良作用。目前的研究思路主要有：利用CRISPR/Cas9系統將顯性致病基因切除；利用CRISPR/Cas9系統對將引起遺傳病的功能基因進行切割，并引入正常的功能基因；利用CRISPR/Cas9系統使用多個單鏈向導RNA同時對多個致病基因切除，獲得療效。此外，CRISPR/Cas9系統也可直接用于體細胞定向基因編輯，將細胞在體外進行定向編輯，再輸入患者體內，達到治療作用。

1.疾病動物模型：2013年，Yang等［4］利用CRISPR/Cas9系統首次在小鼠中實現Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty多基因同時靶向編輯。2014年，Niu等［5］首次利用CRISPR/Cas9系統對食蟹猴基因組進行精確修飾。由于非人靈長類在生理生化、遺傳背景等方面與人類高度相似，因此建立非人靈長類疾病動物模型對于研究多基因控制的復雜疾病（如帕金森氏病）有非常重要的意義。2015年，Zhou等［11］利用CRISPR/Cas9系統敲除豬胎兒成纖維細胞酪氨酸酶基因，然后通過體細胞核移植技術得到成活的酪氨酸酶基因敲除豬，該動物模型有明顯的白化表型。這些研究為遺傳病和代謝病等的治療提供了較好的動物模型。

2.與誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）技術共同用于基因治療：iPS指具有多向分化潛能以及自我再生能力的多能細胞，在疾病治療和疾病模型構建等相關研究中有重要意義。隨著基因組編輯技術的不斷發展，CRISPR/Cas9系統已廣泛應用于修飾iPS基因組。

2014年，Xie等［12］利用CRISPR/Cas9系統成功修復了地中海貧血癥患者iPS的致病基因β珠蛋白基因，并將修復后的iPS細胞繼續誘導分化為正常紅細胞，為地中海貧血癥提供了新的治療方法。2015年，Howden等［13］利用CRISPR/Cas9系統對兩名分別患有色素性視網膜炎和重癥聯合免疫缺陷的患者成纖維細胞進行基因修飾，在矯正致病基因PRPF8和ADA的同時進行重編程形成iPS，將其分化為目的細胞，該研究極大地縮短了遺傳性修復干細胞的獲取時間，為干細胞靶向療法提供新思路。

3.腫瘤治療研究：目前，CRISPR/Cas9系統已應用在腫瘤研究的諸多方面。2014年，Zhen等［14］利用CRISPR/Cas9系統建立了針對引發宮頸癌的人乳頭瘤病毒特異表達的E6和E7基因的編輯系統，并將其轉染進入感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌細胞，細胞的增殖速率明顯減緩。嵌合抗原受體T細胞是一類經過改造且能夠特異性殺傷腫瘤的免疫細胞。2017年，Liu等［15］利用CRISPR/Cas9系統敲除嵌合抗原受體T細胞T細胞受體、人內源性微球蛋白及細胞程序化死亡受體1基因，發現與正常嵌合抗原受體T細胞相比，敲除上述基因的T細胞在體外及體內具有更強的腫瘤殺傷功能。同年，Chen等［16］利用CRISPR/Cas9系統將致死基因敲入癌細胞的融合基因，導致癌細胞死亡，而這種融合基因只存在癌細胞，不存在于健康細胞，極大地提高了基因治療的特異性。

4.皮膚性病學領域：多種免疫細胞功能調節異常，導致免疫系統功能紊亂，釋放大量炎癥細胞因子，使機體炎癥反應加重，是有些皮膚病（如銀屑病、大皰性類天皰瘡等）的可能發病機制之一，CRISPR/Cas9系統在免疫調節中的應用可為這類疾病發病機制的研究和治療提供新思路。2015年，Shi等［17］利用CRISPR/Cas9系統進行全基因組篩查，證實半胱氨酸蛋白酶通過切割介導細胞焦亡的底物蛋白控制炎癥壞死，而炎癥壞死是先天免疫系統對病原體產生的重要免疫反應。2017年，Simeonov等［18］利用一種改進的CRISPR/Cas9系統CRISPR activation（CRISPRa）成功地找到了調控免疫細胞發育的增強子，該序列對于自身免疫疾病的發生有重要作用。

也有科研人員利用CRISPR/Cas9系統探討黑素瘤的發病機制和治療。2016年，Zhu等［19］利用CRISPR/Cas9系統篩選11個lncRNA位點，成功篩選出正向及負向調控人黑素瘤細胞增殖的lncRNA。2017年，Manguso等［20］利用CRISPR/Cas9系統敲除黑素瘤細胞中多個表達基因，進一步驗證細胞程序性死亡配體1和CD47兩個基因被刪除后癌細胞更容易受細胞程序性死亡配體1阻斷。

艾滋病是常見的性傳播疾病，由1型人免疫缺陷病毒（HIV?1）損傷人T淋巴細胞導致免疫系統功能紊亂所致。近來，隨著CRISPR/Cas9系統的不斷發展，研究人員嘗試利用該系統抑制HIV?1在宿主細胞內表達，甚至敲除HIV?1基因片段。2014年，Hu等［21］在HIV?1 長末端重復序列?U3利用CRISPR/Cas9系統進行基因編輯，使得HIV?1在T細胞感染潛伏期中表達失活，同時設計多對單鏈向導RNA對宿主細胞進行基因編輯，將整合前病毒基因組中5′?3′長末端重復序列片段完全切除。2016年，Kaminski等［22］利用CRISPR/Cas9系統在活體動物基因組中敲除HIV?1的一段序列，從而降低HIV?1的感染效率。2017年，Xu等［23］利用CRISPR/Cas9系統突變肝臟造血干細胞CCR5基因，在小鼠動物模型中證明該突變有一定抵抗HIV感染的效果。同年，Yin等［24］利用CRISPR/Cas9系統使HIV?1的復制功能喪失，從而使HIV?1從被感染的細胞中徹底清除。

5.其他：隨著對基因組編輯技術的深入研究，CRISPR/Cas9系統也在不斷改進并應用于多個領域。2015年，Zetsche等［25］發現一種新型CRISPR系統CRISPR/Cpf1。與Cas9蛋白相比，Cpf1蛋白更小，更容易進入細胞。此外，Cpf1在切割DNA后并不是形成Cas9切割后的平末端，而是形成黏性末端，使外源基因更容易插入，而且其識別位點與剪切位置相距較遠，選擇編輯位置更加自由。同年，Ran等［26］在金黃色葡萄球菌中，發現一種新型Cas9酶SaCas9，與經典SpCas9相比，其基因長度減少25%，且可被裝載入腺相關病毒而不影響其包裝和活力，因此，提供了一個方便有效的在體基因操作工具。2017年，Kim等［27］設計出CjCas9并通過腺相關病毒將其轉入小鼠肌細胞和視網膜色素上皮細胞，將黃斑變性相關的兩個基因血管內皮生長因子A和血管內皮生長因子A轉錄因子低氧誘導因子1a敲除，從而減少脈絡膜新生血管，為該病的治療提供新的選擇。單堿基基因編輯技術是在CRISPR/Cas9系統基礎之上對Cas9蛋白進行改造，實現不依賴于DNA斷裂而能夠將DNA四種堿基A、T、G、C進行替換的編輯技術，該技術極大地提高了基因的精確修復效率［28?29］。

三、目前存在的問題及應用前景

與其他基因組編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統具有許多優勢。首先，其有更高的基因編輯效率；其次，CRISPR/Cas9系統識別靶位點僅需關注原型間隔序列毗鄰基序區的3個堿基，構建方便，簡單快捷［30］；最后，CRISPR/Cas9系統可以同時編輯基因組中多個基因位點，可在研究由多基因突變引起的復雜疾病中發揮重要作用。

作為一種革命性技術，CRISPR/Cas9系統仍存在不足，其中脫靶效應一直是該技術需要克服的重大技術問題。2016年，Doench等［31］對單鏈向導RNA結構進行優化，使CRISPR/Cas9系統的脫靶率大幅降低。同年，Ran等［32］將單鏈向導RNA 5′端的互補序列減少，由17或18個互補的核苷酸組成，這與未減短的單鏈向導RNA打靶活性相同，提高了單鏈向導RNA配對靶位的敏感性，同時降低了脫靶位點引起的突變效應。另外，優化Cas9蛋白結構也可降低CRISPR/Cas9系統的脫靶效率。2016年，Kleinstiver等［33］通過改造高保真SpCas9蛋白使CRISPR/Cas9系統的脫靶效率顯著降低，而打靶效率并未受此影響。2015年，Slaymaker等［34］通過改造Cas9酶的3個氨基酸位點，極大降低了CRISPR/Cas9系統的脫靶效應。2017年，Chen等［35］突變Cas9中REC3的氨基酸殘基，在減少脫靶效率的同時保持高效的敲除效率。另外，基因復雜的調控機制以及功能多樣性使CRISPR/Cas9系統存在不可預知的風險，在基因編輯之前必須明確所敲除基因的功能作用，以避免出現在編輯致病基因的同時增加其他疾病的患病風險。與體細胞編輯相比，生殖細胞的基因編輯在影響個體的同時也對后代產生影響，進而可能改變其物種遺傳軌跡。

隨著CRISPR/Cas9系統不斷的發展和完善，CRISPR/Cas9系統自身存在的一些局限性將不斷被克服，相信在不久的將來該系統可以為基礎研究、疾病預防和治療等提供更加高效簡單的方案。