孕中期無創DNA產前篩查與妊娠結局的研究

黃 貞

(廣西百色市人民醫院產科，廣西 百色 533000)

我國為全球新生兒出生缺陷的高發國家，每年新發先天畸形兒可占到總出生人口數的4%～6%，其中又以21-三體綜合征(唐氏綜合征，DS)、18-三體綜合征(愛德華氏綜合征，ES)及神經管缺陷(NTD)等較為多見[1]，患兒出生后多伴有不同程度神經或結構畸形，嚴重影響人口素質及帶給給社會和家庭嚴重負擔，由目前于缺乏有效治療手段，因此通過產前篩查和診斷預防此類新生兒具有積極的意義。介入性產前診斷是染色體異常檢測金標準，但其有創性操作具有一定潛在風險，而血清學生化指標篩查假陽性率較高、敏感性較低。近年來妊娠母體外周血中發現游離胎兒DNA為無創產前篩查和診斷提供了新途徑[2]。本文通過對孕婦外周血中胎兒游離DNA進行檢測，來評估無創DNA篩查的可行性與準確性，并對妊娠結局進行隨訪。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2013年1月～2016年9月在我院產前門診自愿接受無創DNA產前檢測的1 036例孕婦為研究對象，孕周為10～21+6周，年齡19～45歲，平均(33.61±4.53)歲。接受無創DNA檢測的孕婦情況主要包括以下個類型：①單純高齡(≥35歲)；②唐氏綜合征篩查提示高風險，即21-三體風險值≥1/270、18-三體風險值≥1/350；③產前超聲檢查提示異常，如胎兒頸項透明層厚度(NT值)異常、胎兒結構異常；④既往有不良生育史；⑤自愿直接行DNA檢測。接受無創DNA的孕婦情況：唐篩異常356例(34.36%)，高齡527例(50.87%)，自愿直接DNA檢測92例(8.88%)，超聲檢查異常39例(3.76%)，既往不良孕產史22例(2.12%)。

1.2方法：DNA檢測方法：抽取孕婦靜脈外周血10 ml，孕婦無需空腹，樣本置于EDTA抗凝管中，在44℃條件下經二次離心分離血漿，將提取所得血漿樣本置于-80℃冰箱中能保存待測。血漿樣本嚴格按照試劑盒說明書提取DNA，經PCR擴增構建測序的DNA文庫，之后采用I2-ples高通量hiseq 2000測序儀進行測序，將所測得序列與人類基因組數據庫進行對比分析，計算每條染色體序列數目比率。通過公式計算樣本染色體的標準化Z值，如Z值≥3，則認為待測樣本為三體高危，反之如Z值<3，則為三體低危。對于提示為高危孕婦者則動員其進行羊水穿刺取樣對染色體核型分析確診。

羊水染色體核型分析：對于DNA檢測提示高風險的孕婦，在B超引導下型羊膜腔穿刺，抽取羊水樣本進行離心，取沉淀物在37℃、5%二氧化碳培養箱進行羊水細胞培養，培養合適天數后，經處理后得到羊水細胞標本片，進行染色體核型分析。

2 結果

2.1無創DNA檢測結果：1 036例標本中共檢出21、18、13-三體綜合征29例，占2.79%，以21-三體綜合征最為多見。具體見表1。

表1無創DNA檢測結果(例)

情況例數21三體18三體13三體性染色體異常合計唐篩異常356820010高齡52762109自愿直接DNA檢測9220103超聲檢查異常3911002既往不良孕產史2222105合計10361973029

2.2無創DNA檢測與羊水細胞核型分析結果對比：羊水細胞核型分析結果對比，21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征無創DNA檢測符合率分別為10例(100%)、8例(88.89%)和3例(100%)。

2.3妊娠結局：確診的10例21-三體者中，自然流產2例，引產8例，無明顯原因死胎0例，出現不良妊娠結局者0例；8例18-三體者中，自然流產2例，引產3例，無明顯原因死胎2例，出現不良妊娠結局者1例；3例13-三體者中，自然流產0例，引產2例，無明顯原因死胎1例，出現不良妊娠結局者0例。

3 討論

傳統的產前診斷方法如羊水穿刺、絨毛穿刺等仍是目前產前診斷金標準，雖然能經常規細胞培養和染色體核型分析獲得準確結果，且覆蓋面較廣，但均為侵入性有創操作，其細胞培養需要較長周期才能獲得最終報告，且具有較大的感染、出血甚至流產等風險，尤其是近年來計劃生育政策放寬及二胎政策的出臺使得高齡孕婦逐漸增多，有創性操作帶來更大風險，難以得到孕婦及家屬的接受。上世紀90年代國外研究發現孕婦血液循環中存在胎兒游離DNA存在，通過測序技術測定母血漿細胞游離胎兒DNA片段可以確定胎兒染色體倍性[3]，進一步研究分析顯示孕婦血漿中的胎兒DAN是以高濃度存在，在孕早期、孕晚期可分別占到血漿DNA總量的3.4%、6.2%，而且在孕7周時孕婦血漿中即可檢測到胎兒DNA片段，隨著孕周的增加DNA片段濃度也會隨之增高[4]。國內研究表明在高風險孕婦孕中期篩查診斷出21-三體8例、18-三體1例及無腦兒1例，隨訪發現高風險未行產前診斷而出生的唐氏兒1例，染色體數目異常嵌合體均選擇引產或中止妊娠，認為孕中期產前篩查診斷對減少出缺陷極其關鍵[5]。

本研究1036例孕中期孕婦經無創DNA檢測顯示標本中共檢出21/18/13-三體綜合征29例，占2.29%，以21-三體綜合征共10例，最為多見，這在其他研究[6]中也得到體現。進一步的分析顯示與羊水細胞核型分析結果對比，21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征無創DNA檢測符合率分別為100%、88.89%和100%，與其他研究基本一致。熊敏等[7]報道5例孕婦血胎兒無創DNA檢測5例提示21三體綜合體者，均經羊水和臍血染色體證實異常，符合率達100%。章容等[8]報道對母血胎兒游離DNA大規模平行測序提示異常的89例進行羊水核型分析對比，結果發現21例-三體、18-三體符合率分別為100%(28/28)、87.5%(7/8)。雖然也有研究[9]認為傳統侵入性羊水核型分析結果在檢測陽性率方面要高于無創DNA，但總體來說目前的研究大多數支持兩種方法診斷符合率較高的結論。

從我國現狀來看染色體異常仍是導致新生兒出生缺陷的重要原因之一，其中又以21-三體綜合征較為多見，隨著無創DNA檢測技術提高、信息分析方法優化及檢測樣本量的增多，該技術在胎兒染色體篩查的應用逐漸廣泛，診斷準確性也不斷提高。從孕婦外周血對胎兒游離DNA進行染色體診斷，其結果不受孕婦孕周、生育年齡影響，不會對孕婦或胎兒帶來額外創傷，經總結我們認為該技術適合以下情況：①年齡≥35歲周歲的單純高齡孕婦；②唐氏綜合征篩查提示高風險、產前超聲檢查提示異常，且不愿意選擇傳統侵入性產前診斷檢查者；③既往有不良生育史者；④傳統侵入性產前診斷檢查失敗不愿意再次侵入性操作者；⑤自愿接受無創DNA產前診斷者。

綜上所述，孕中期無創DNA產前篩查在21/18/13-三體綜合征診斷方面與羊水細胞核型分析結果的診斷符合率較高，且具有快捷、無創、準確率高等優點，有望成為一種廣泛普及的非侵入性產前篩查新手段。

[1] 吳清明，周 瑾.出生缺陷產前篩查及產前診斷研究進展[J].中國優生與遺傳雜志，2011,19(1)：129.

[2] 廖 茜，李 力.胎兒游離DNA用于無創產前診斷的研究進展[J].人民軍醫，2013,56(9)：1084.

[3] 張有成.母血漿游離胎兒DNA檢測在無創性產前診斷中的應用[J].中國優生與遺傳雜志，2013,21(5)：1.

[4] 鄭 靜，卓 越，孫大康，等.不同年齡段孕婦無創DNA產前檢測結果對比分析[J].中國婦幼保健，2015,30(36)：6538.

[5] 胡祝明，劉祥印，陳 爽，等.15486例孕中期篩查孕婦妊娠結局隨訪結果分析[J].中國婦幼保健，2014,29(3)：361.

[6] 陸海燕，鄭建麗，楊芳芳，等.孕婦外周血胎兒游離DNA檢測在無創性產前診斷中的應用[J].中國優生與遺傳雜志，2014,22(10)：78.

[7] 熊 敏，孫 輝，王淑媛.孕婦血胎兒無創DNA產前檢測的臨床應用探討[J].中國優生與遺傳雜志，2015,23(4)：46.

[8] 章 容，徐聚春，許歡歡，等.5997例母血胎兒游離DNA無創大規模平行測序篩查胎兒染色體數目異常[J].第三軍醫大學學報，2013,35(16)：1744.

[9] 徐冠英.無創產前DNA檢測與傳統產前診斷在產前診斷中應用的比較分析[J].中國優生與遺傳雜志，2016,24(2)：74.