低溫庫保存藥用植物種質資源所面臨問題探討

徐紅霞，裴瑾，彭成，馬云桐，楊梅，吳清華

藥用植物種質資源是中醫藥事業發展的基礎，是中藥新藥、植物藥開發、優良品種選育的基因來源。自古以來，藥用植物資源是人類使用最多的天然藥用資源，據第三次全國中藥資源普查的資料統計，我國的藥用植物資源11 000余種，分布于385個科，其中種子植物223科，占中國藥用植物總數的90 %以上[1]。《中藥材保護和發展規劃(2015—2020年)》提出建設野生中藥材資源保護工程，開展第四次全國中藥資源普查，建立全國中藥資源動態監測網絡，建立中藥種質資源保護體系；《中醫藥發展戰略規劃綱要(2016—2030年)》提出加強中藥資源保護利用，建立國家級藥用動植物種質資源庫。植物種質資源庫是指以植物種質資源為保護對象的保存設施，而低溫種質資源庫是保存植物種質資源的最佳途徑。自1958年美國國家種子貯藏實驗室率先建立世界上第一座國家級現代化低溫種子庫以來，目前全世界已建成各類種質庫1700余座，收集了植物種質資源740多萬份（含各國重復保存部分），其中約90 %是以種子體的形式保存于全球上千座低溫種質資源庫中[2]。隨后英國的千年種子庫、挪威斯瓦爾巴全球種子庫相繼建立。國家中藥種質資源庫的建立對確保藥材質量，發現新品種及選育良種，保存生物多樣性，保障藥用資源的可持續利用具有重要意義。隨著新技術和新方法的應用，低溫種質庫保存種質資源的機制也越來越完善，但我國專業性中藥（藥用植物）種質資源低溫庫建設工作比較滯后，大多是借鑒農作物資源庫的保存體系，其中仍是面臨一些問題。本文對目前低溫種質資源庫保存藥用植物種質資源面臨的問題進行探討和分析，并根據目前藥用植物種質資源保存的實際情況，提出了改進和完善建議。

1 低溫庫保存藥用植物種質資源的基本情況

種質資源庫是以種質資源為對象的貯藏設施，其最大的特點是被保存材料是活體物質。低溫種質庫的貯藏對象是耐低溫、干燥的正常型種子，種子在低溫低濕條件下可大大延長其貯藏壽命。低溫種質庫以貯藏期長短可分為短期庫、中期庫和長期庫。短期庫（臨時庫）庫溫在15±2 ℃，RH＜50 %，供鑒定、研究和分發用，屬臨時保存的應用材料；中期庫庫溫在-4±2 ℃（或4±2 ℃），RH＜60 %，儲藏壽命5～10年，主要用作分發材料；長期庫庫溫-18±2℃，RH＜60 %，貯藏壽命可達20年以上，任務是長期貯存，一般不作分發用，當分發材料用完時可以用作繁殖材料提取，所以也叫基礎庫[3～4]。我國藥用植物種質資源庫建設工作起步較晚，“七五”期間在浙江中藥研究所建立的我國首座設計容量為200種計5萬份的藥用植物種質資源庫，使得保護和合理開發利用藥用植物種質資源工作邁出了重要的一步，但由于經費原因沒有啟用[3]。2005年在中國醫學科學院藥用植物研究所建設的我國首個現代化國家藥用植物種質資源庫，是我國也是全世界收集和保存藥用植物種質資源最多的專業種質庫，目前完成入庫的野生、栽培藥用植物種質近3萬份，實現了對193個科1017個屬種子的長期保存，保存期為50年[3,5～7]。2012年國家分別在四川和海南啟動了國家中藥種質資源庫，四川庫建在成都中醫藥大學，擬將完成第四次中藥資源普查所收集中藥種質資源的保存，預計共收集、保存種質資源達5萬份，庫容量20萬份。

2 低溫庫保存藥用植物種質資源面臨的問題

2.1 藥用植物種質資源庫的構建工作難度大

藥用植物不同于大田作物，大田作物的產量、品質等經濟性較藥用植物易于控制。而藥用植物作為中藥材，除了要考慮其產量外，還要考慮到其有效成分的含量，藥用植物的有效成分一般為其次生代謝產物，含量極微[8]。同時，在我國藥用植物資源中，栽培品種有300多個，絕大部分為野生資源，受藥用植物的藥用部位影響，無論是人工種植還是野生的藥用植物資源，為滿足最適采收期的要求，一般在種子成熟前就已經完成采收，給種質的收集增加了難度[9]。另外，藥用植物種質資源帶有明顯的地域性，中藥資源的任何研究都離不開道地性研究，而道地藥材是一個約定俗成的概念，對其內在的生物學方面沒有詳細的闡述。加之藥用植物種質資源庫的研究及建設工作未受到應有的重視，導致我國藥用植物種質資源庫的構建工作難度加大，進展緩慢。

2.2 種質低溫保存過程中對種質安全保存期缺乏關注

種質保存壽命一般是指種子保存至其發芽率降低至50 %或者完全喪失生活力所需要的時間，而在種質資源保存領域，過低發芽率的種子不具備保存的意義。在常規條件下，種子貯藏生命力周期較短，種子保存的有效性與安全性受到影響，人們開始研究影響種質壽命的原因，探索延長種質壽命的方法[10]。1972年Harrington提出了兩條種子壽命通則：在一定溫度范圍內，貯藏溫度每降低5 ℃（溫度在50～0 ℃）或種子含水量每降低1 %（含水量在14 %～4 %），種子壽命可延長一倍。聯合國糧食及農業組織（FAO）[4]正是基于上述理論基礎，提出了種質中長期貯藏的種子含水量和儲藏溫濕度技術標準。

種質安全保存的含義可以理解為，通過采取有效的保存技術，最大限度地減少種質在貯藏和更新過程中發生遺傳漂移，以維持每份種質的遺傳完整性。因此，種質資源在保存過程中，需要在種子發芽率降到一定程度時進行繁殖更新。種子從入庫保存至其發芽率降低至更新發芽率下限的這段貯藏時間，即為種質的安全保存期。FAO[4]推薦了種質庫種質資源更新發芽率的下限標準，即發芽率降至入庫初始值的85 %。由此可見，種質的安全保存期比種質的保存壽命短。有關種子保存的研究多數是分析或經過數據模擬種子的保存壽命，而對種質安全保存期幾乎沒有關注，中藥種質資源低溫庫和常溫保存條件下實測獲得的安全保存期更是報道罕見。在作物方面，宋超[10]等對水稻和小麥種質資源安全保存進行了研究，研究結果表明，除了與溫度、種子含水量等保存條件有關外，種質安全保存期還受諸如種質初始質量、品種類型、遺傳特性等因素的影響。然而，種子在長期保存過程中的衰老是不可避免的[11]，因此，種質的安全保存期在種質資源保存過程中不可忽視。所以，在低溫條件下種質資源安全貯藏多少年已成為人們高度關注的問題。

2.3 種質低溫保存過程中種質的生活力喪失

低溫種質庫是植物種質資源保存的最主要方式，種子成熟后開始進入衰老過程，即使在目前認為較為安全的種子庫（低溫低濕）貯藏條件下，種子生活力仍在緩慢喪失。有研究表明，長期庫保存的西紅柿種子，保存10年后發芽率仍然與初始值十分接近；但洋蔥種子，在保存5年后發芽率就降至50%[12]。對國家庫貯藏20年以上種子生活力與田間出苗率監測研究中，92.9 %的被監測種子發芽率仍保持在85 %以上，但小麥等6種作物的田間出苗率比入庫初始發芽率低20 %以上，而且有8份種子出苗率低于10%[13]。在其他國家種質庫中也有類似的報道，例如在美國國家種質庫中，780份花生保存34年后平均發芽率從89%降至6 %，3635份大豆種子保存36年后發芽率從起始的92 %降至21 %，427份小麥種子保存43.6年后發芽率從94 %降至73 %[14]。波蘭國家植物遺傳資源中心保存的4000份冬小麥中，有4 %的種子保存10年后發芽率不足80 %[15]。

而目前有關于藥用植物種質資源低溫保存過程中生活力喪失的研究比較少。于-10±1 ℃保存的紅麻種子，初始發芽率為88 %，31年后種子發芽率仍然在79.7 %以上[16]；而紫云英種子在-1 ℃保存20年后，其發芽率不足初始的50 %[17]。金鉞[5]等對國家藥用植物種質資源庫中期庫保存4年的荊芥、黃芩、桔梗、益母草、穿心蓮、黨參、冬凌草等7種藥用植物進行種子生活力的檢測，發現種子發芽率均下降，除荊芥、黃芩種子發芽率下降不顯著外，降幅為4.9 %和5.4 %，其余5種藥用植物的種子發芽率顯著下降，降幅分別為8.9 %、12.0 %、12.2 %、14.3 %和17.0 %。因此，低溫貯藏只能延緩而不能阻止種子的衰老，且不同品種間的種子生活力喪失的差異非常大。

2.4 種質低溫貯藏過程中發生遺傳變化，急需制定種質更新標準

種質資源保存的目的是既要保持種子生活力，又要保持其遺傳完整性。維持種質的遺傳完整性，即是在種質貯藏過程中要保持其最低程度的遺傳改變，在繁種過程中要保持子代與親代具有最大的遺傳相似性。因此，種質遺傳完整性變化有兩方面含義：一是指種質貯藏過程中的遺傳變化，如染色體畸變，DNA、RNA等遺傳變化，以及所產生的遺傳效應；二是指種質繁殖后，其子代種質群體的遺傳組成與親代種質群體相比較發生了變化[18]。然而許多研究報道指出，種質在貯藏過程中會發生遺傳上的變化[19～21]。其主要原因：一是貯藏期間老化種子誘導染色體、DNA等發生變化；二是由于種子在貯藏和更新過程中遭受遺傳選擇，即遺傳上異質種子樣品中遺傳變異性的喪失。

染色體畸變、DNA、RNA等遺傳變化在種子衰老過程中是一種普遍現象，它是種子老化作用的結果。葛榮朝[22]等研究結果表明，種子經過長期貯藏，往往會出現染色體畸變率顯著升高而發芽率明細降低的現象，而種子在萌發過程中出現的大量異常細胞分裂是造成染色體畸變和發芽率降低的重要原因之一。張晗[21]等研究人工老化的玉米種子，經SSR分析發現，低發芽率群體的多態性條帶百分率、等位基因數、有效等位基因數、基因多樣性指數、Shannon指數等遺傳參數，與對照群體的遺傳參數相比都有所下降，表明種子老化處理后群體內的遺傳多樣性低于對照群體的遺傳多樣性，群體內遺傳變異出現下降。

對于種質資源，FAO推薦的更新標準是85 %，這是因為低的更新發芽率標準會造成以下結果：（1）混合群體中存在著不同基因型，若更新發芽率低，不僅不同存活組分的遺傳變化大，而且發生某些基因型喪失的危險性也大；（2）種子的發芽率與種子活力呈正相關性，即低發芽率的種子，其活力也低；（3）在更新過程中，對于群體中存活基因型較差的種子，遭受遺傳選擇的危險性會增大。但是這種標準對于種質保存的種子可能過高，因為庫存種子的起始發芽率通常很高，參照這個標準則可能會導致頻繁的繁殖更新。而對于藥用植物種質資源在低溫保存過程中遺傳完整性的報道則近似于無，Jaroslava等[23]研究了經過4到10 次繁殖更新后的豌豆種質遺傳變化，遺傳完整性有明顯的變化，認為即使是自花授粉作物和高度同質性作物，在多次繁殖更新后也面臨著喪失遺傳完整性的風險[12]。因此，我們需要盡量延長種子的貯藏壽命，以降低頻繁更新可能會帶來的遺傳變異。

更新標準的確定，除了從遺傳學基礎考慮外，還要考慮種子生活力的喪失特性，盡可能在種子生活力快速下降之前更新。盡管染色體畸變率與種子生活力存在負相關性，但目前的研究仍無法找到種子的生活力臨界值水平，在繁殖更新次數和繁殖更新發芽率水平之間找到平衡。因此，加強對種子衰老和遺傳完整性的研究，制定適當的種質更新標準是種質庫管理者面臨的一大難題[12,24]。

3 藥用植物種質低溫保存改進及策略

3.1 建立和完善藥用植物種質資源保存體系

低溫種質資源庫中，所有貯存種質的外在貯藏條件是相同的，因此，影響種子生活力喪失快慢的因素就取決于種子本身的遺傳因子和貯藏前的環境條件。然而種子本身的遺傳因子對生活力喪失的影響是無法控制的，所以除種子本身的遺傳特性外，貯藏前種子的質量及環境條件是影響生活力喪失的另一重要因素。

研究表明，貯藏壽命會受到許多因素的影響，如物種或品種自身壽命長短，種子生長和收獲期間的氣候條件，種子收獲后的脫粒、干燥及運輸，存放以及入庫前處理等[25]。分析由不同單位繁種的小麥種子經長期庫保存后的生活力差異，發現不同繁種單位提供種子生活力下降快慢不一致，可能是由于繁種地氣候等環境差異對種子產生不同的影響[13]。有研究發現高溫高濕在大豆種子發育和成熟過程中可以導致種子在收獲前就發生劣變[26]。有報道指出，金錢松種子在低溫貯藏的最佳含水量在5 %～6 %[27]；川牛膝含水量在5.7 %左右時，其種子活力及抗老化能力較強[28]。而當歸種子在陰涼處保存的最佳含水量為2.85 %，并且有利于種子的后熟作用[29]，而根據FAO種質庫保存的種子含水量為5～8 %。由此可見，是否制定各種子長期保存的最理想貯藏條件，還有待進一步研究。

因此，種質安全保存工作應從繁種工作開始，充分重視各個環節的質量把關，確保種子發育期、收獲期和保存前處理期均處于最佳環境條件，控制種子初始質量和含水量，并采用合適的包裝材質、保存溫度等[10]，在此基礎上建立藥用植物種質資源最佳保存體系。

3.2 做好種質生活力監測和更新標準工作

隨著種質資源庫收集和保存的量越來越多，需要對不同種質定期進行抽樣監測，以便更安全的貯藏更多種質和確定各種質繁殖更新時間。藥用植物種質資源保護工作起步晚，到目前為止沒有系統開展種子生活力監測工作，為確保藥用植物種質資源得以長期安全保存，可參照國家庫農作物種質資源的保存體系，制定種質生活力監測和更新方案。

首先，增加生活力監測頻率，不耐貯藏的種質資源應作為重點監測對象，對生活力整體出現明顯下降的某些繁種單位提供的種子，亦應作為重點監測對象。其次，生活力監測應逐份進行，不宜采用抽測方式，并增加活力監測內容[13,22]。再次，確定適宜的種質發芽率更新標準[13]，有研究發現，水稻等作物種子生活力出現快速下降的拐點發芽率水平約為73±2 %，并認為有必要在降至該水平之前更新[30]。因此，對于不同品種的藥用植物種質資源，應制定各自的種質發芽率更新標準；開展種子生活力喪失預警指標及無破壞性的種子生活力、活力監測方法的研究，以提高種質衰老的預警能力；開展提高田間出苗率技術與方法研究，尤其是提高野生藥用植物種子的出苗率和成苗率等技術的研究[17]。

4 結語

藥用植物種質資源是中醫藥產業的源頭，對我國中醫藥的發展有著舉足輕重的作用。因此，藥用植物種質資源庫的建設，對藥用植物種質資源的保存尤為重要，具有長期性和穩定性的優點，其最終目的是保持種子樣品的活力、遺傳完整性和質量以及使得它們可以利用。但我國藥用植物種質資源保存技術開展較晚且建設工作是借鑒于農作物的保存體系，其中依然存在種質健康并長期儲藏的問題，如何解決這些問題，還需要廣大學者的共同努力。