蕎麥生物活性肽的研究進展

李 蒙

(西安文理學院 生物與環境工程學院,陜西 西安 710065)

蕎麥廣泛分布于中國山區,特別是西南地區,包括四川、貴州等地,除此以外,在俄羅斯、日本等國家也廣泛種植,常見的品種是甜蕎和苦蕎。蕎麥種子含有多種生物活性成分,如豐富的蛋白質、黃酮化合物、肌醇等,蕎麥蛋白在某種程度上與雞蛋、牛奶中的蛋白功能相近[1],且其組成蛋白質的氨基酸種類全面，配比得當,含有大量的賴氨酸、精氨酸和其它必需氨基酸,因此,具有營養價值的蕎麥蛋白被用于彌補谷類和蔬菜類蛋白的緊缺[2]。

蕎麥具有很多重要的生物活性物質,已研究表明其對多種慢性病有很好的療效,如高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥和便秘[3]。生物活性肽是具有生物學活性的數個氨基酸組成的多肽,具有不同的生理學功能[4]。深入研究具有特殊生物活性的蕎麥小分子活性肽,對于蕎麥蛋白資源的開發利用具有重要的意義[5]。

1 蕎麥中胰蛋白酶抑制劑

在過去的幾十年里,從蕎麥種子中分離出了多種蛋白酶抑制劑,然后根據氨基酸序列和酶活性特征被劃分為不同類,它們在中性和酸性條件下普遍具有熱穩定性。最開始人們將苦蕎胰蛋白酶抑制劑分為永久性和短暫性兩種[6-7],永久性胰蛋白酶抑制劑的特征是序列N端以亮氨酸為起始,由51～67個氨基酸組成;短暫性胰蛋白酶抑制劑的特征是序列N端以絲氨酸為起始,由85～99個氨基酸組成,比如蕎麥蛋白酶抑制劑BWI-1(LRQCSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLPEGSAVPRDLRCDRVWVFV DERGVVVDTPVVM)和BTI-1(LRQSCGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLPEGSAVPRDLLCD RVDVFVDERGVVVDTPVVM)為永久性抑制劑[8-9],蛋白酶抑制劑BWI-2a(SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDDFQRQQRGGGGSSD)和BWI-2b(SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDD FQRQQRGGGGSSDEGN)為短暫性抑制劑[5]。后來學者們發現了由41個氨基酸組成的胰蛋白酶抑制劑BWI-2c(SEKPQQELEECQNVCRMKRWSTEMVHRCEK KCEEKFERQQR)[10],由4個半胱氨酸形成分子內二硫鍵。相關結構研究表明,半胱氨酸的數目和二硫鍵的形成是蕎麥蛋白酶抑制劑的三維立體結構所必需的；之后發現的BWI-4a抑制劑有兩種異構酶(序列1:ECSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLP EGSAVPRDLRCDRVWVFVDERGVVVDTPVVM和序列2:ECSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAI VLPEGSGVPRDLRCDRVWVFVDERGVVVDTPVVM),它們之間的差別是第40位氨基酸的種類(丙氨酸和甘氨酸)[11]。以上所有的胰蛋白酶抑制劑都是在甜蕎中發現的,而從苦蕎種子中分離的FtTI(LIYAKVKCLITGVRTYVGKQSWPELVGTKGKTAAATIDKENAHV TAVLCPPLTTLATCRTFDFRCDRVRVLINRIGGVVTKT PTVG)蛋白酶抑制劑是由86個氨基酸組成的[12]。

相關生理活性研究表明，蕎麥蛋白酶抑制劑可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,而對胰凝乳蛋白酶的作用效果不顯著。離子交換色譜分析表明,蛋白酶抑制劑可以劃分為陰離子和陽離子抑制劑,如蕎麥中的BWI-1、BTI-1和BWI-4a屬于陰離子抑制劑,而其它植物和細菌中的BWI-4c(GRGCQGLQEEPELVGTRGPA)屬于陽離子抑制劑[13]。除了抑制酶活性外,蛋白酶抑制劑還具有抗菌性,蕎麥蛋白酶抑制劑已被證實具有抑制HIV-1反轉錄酶活性和多種癌細胞增殖的作用[14]。蕎麥作為功能性糧食作物,一直得不到廣泛的開發利用,主要在于其產品口味一般以及蛋白質的低消化率,這種低消化率是由于蕎麥中胰蛋白酶抑制劑和其它蛋白酶抑制劑影響的結果。

2 蕎麥中抗菌肽

蕎麥在生長中會面臨許多不利的環境,例如低溫、干旱和病菌感染等,經過長期的進化,蕎麥已具備抵抗害蟲和病菌侵染與損傷的活性物質。研究發現從蕎麥種子、麩皮和外殼分離的抗菌肽具有對多種致病菌的抗菌作用[15]。

植物防御素一般由45～54個氨基酸組成,結構中含有由8個半胱氨酸組成的4個二硫鍵[16]。目前,已經從小麥、大麥和其它植物中分離與鑒定出多種防御素,其結構與動物、人類防御素的結構有相似性[8]。人們從甜蕎中分離出兩種抗細菌肽Fa-AMP1(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCK)和Fa-AMP2(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQW GWCGSTPKYCGAGCQSNCK),它們由40個氨基酸組成,分子內有4個二硫鍵結構[17]。抗菌活性分析表明Fa-AMP1和Fa-AMP2可以抑制真菌和細菌的生長[14]。抗菌活性實驗表明蕎麥胰蛋白酶抑制劑BWI-2c具有抵抗微生物感染的功能[10]。還有從苦蕎種子中分離的FtTI抗菌肽,其由86個氨基酸組成,分子量為14 kDa,含有兩個二硫鍵,活性分析表明FtTl在濃度為30 μg/mL時可以完全抑制植物病原真菌(Mycosphaerellamelonis、Alternariacucumerina、Alternariasolani、Phytophthracapsici和Colletotrichumglaeosporioides)的生長[12]。還有蛋白酶抑制劑家族中的BWI-1同樣可以抑制真菌(Alternariaalternata和Fusariumoxysporummycelia)的生長[18]。將BWI-1基因轉入煙草和馬鈴薯中,發現能抑制Pseudomonassyringaepv.tomato和Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis[19]。

3 蕎麥蛋白質對高膽固醇和肥胖的療效

組成蕎麥蛋白質的獨特氨基酸序列能降低小鼠血漿膽固醇,對高膽固醇血癥有治療作用[20]。當未經消化的蕎麥蛋白進入胃腸道后,會引起中性固醇的大量流失,擾亂肝腸循環,降低肝膽固醇濃度[21]。通過用蕎麥蛋白喂養倉鼠,刺激膽汁的合成和排出更多酸性和中性類固醇,可以防止膽結石的形成[22]。研究發現從苦蕎粉碎物中得到的TBP能減少大鼠血清膽固醇，下調NPC1L1和膽固醇乙酰轉移酶活性,影響膽固醇的吸收[23-24]。

與其它動植物蛋白質(如動物酪蛋白和大豆蛋白)相比,提取的蕎麥蛋白不但能更有效地降低血液中LDL、VLDL和膽固醇的含量,而且能降低肝脂肪生成酶的活性,例如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和脂肪酸合成酶；此外，蕎麥蛋白在其消耗過程中能降低肝臟與血漿中三酰甘油濃度，減少脂肪墊濕重[25-26]。

4 蕎麥蛋白質的降血糖作用

調查表明食用蕎麥能降低高血壓、血脂紊亂和高血糖的發病率[27]。在蕎麥中抗糖尿病的化合物主要為肌醇、黃酮和蛋白質,黃酮化合物中的蘆丁、槲皮素和其它黃酮類化合物能對氧化應激和脂類代謝規律進行調節[28-30]。活性氧(ROS)會損傷胰島細胞膜，引起糖尿病；而攝入蕎麥蛋白后被證明通過增加抗氧化酶活性和消除ROS來治療糖尿癥[31-32]。蕎麥幼芽的抗氧化活性能抑制炎癥的發生和改變糖尿癥患者的葡萄糖耐受性[33-34],通過酶解將蕎麥蛋白質裂解成多肽,增加了清除自由基活性和鐵離子螯合活性[35]。從消化后的蕎麥蛋白質中獲得4種抗氧化多肽,分別被命名為WPL、VPW、VFPW和PW,它們比經胃蛋白酶和胰酶消化后的蕎麥蛋白質混合物具有更強的清除自由基的能力[36]。因此,探究蕎麥蛋白質或多肽對脂質過氧化作用和糖尿病的治療作用具有重要的意義,可以作為治療它們的有利候選藥物。

5 蕎麥的降壓肽

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAS)在高血壓調節過程中起到重要作用,其中血管緊張素Ⅱ是主要的效應肽,而血管緊張素轉化酶(ACE,EC3.4.15.1)催化血管緊張素Ι轉化為血管緊張素Ⅱ,引起血壓增加[37]。從蕎麥中獲得的多種小分子多肽能抑制血管緊張素轉化酶的活性,這些小分子多肽主要由2～5個氨基酸組成。早期人們就從水解后的苦蕎蛋白質中分離到了11種抑制肽,分別為FY(Val-Lys)、FY(Phe-Tyr)、AY(Ala-Tyr)、LF(Leu-Phe)、YV(Tyr-Val)、YQ(Tyr-Gln)、YQY(Tyr-Gln-Tyr)、PSY(Pro-Ser-Tyr)、LGI(Leu-Gly-Ile)、ITF(Ile-Thr-Phe)、INSQ(Ile-Asn-Ser-Gln),其中AY、FY、LF和YV與先前報道的ACE活性抑制肽序列一致[38],之后從發酵的蕎麥芽中純化出6種降壓肽,分別為DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART(Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、FQ(Phe-Gln)、VAE(Val-Ala-Glu)、VVG(Val-Val-Gly)和WTFR(Trp-Thr-Phe-Arg),這些天然多肽對自發性高血壓大鼠具有降壓作用[39]。研究發現多肽中的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸與血管緊張素轉化酶的活性中心相結合,通過此方式產生抑制活性作用[40]。而蕎麥降壓肽幾乎都具有相似的結構,C端都是酪氨酸,例如FY、AY、YQY、PSY和DVWY,然而GPP(Gly-Pro-Pro)的C端氨基酸是脯氨酸,因此,酪氨酸和脯氨酸對ACE的抑制作用很重要[41]。

6 蕎麥抗癌蛋白質

早期發現BWI-1和BWI-2a對人的T-All細胞系(JURKAT和CCRF-CEM)具有抑制活性,其引發腫瘤細胞凋亡的機理與細胞DNA的變性或破碎有關[42]。從苦蕎中克隆得到胰蛋白酶抑制劑基因,經表達獲得具有活性的重組胰蛋白酶抑制劑(rBTI),通過上調Bax和Bak、下調Bcl-2和Bcl-xl，經線粒體凋亡通路誘導EC9706、HepG2和HeLa細胞凋亡[43]。通過噻唑比色法和血細胞計數分析,發現rBTI能抑制IM-9細胞和HL-60細胞的增殖[44]；經rBTI晶體結構分析,發現酪蛋白酶抑制劑的作用機理與其分子構象變化有關[45]。因此,通過內吞作用和膜電位變化,rBTI能進入HepG2細胞[46]。

研究表明蕎麥蛋白經消化可阻礙二甲基苯丙蒽誘導性乳腺腫瘤的發生[47],蕎麥蛋白類產品也已經被證明通過降低c-myc和c-fos蛋白的表達,抑制大鼠大腸癌的發生和抑制細胞增殖[48]。還有學者發現了一種分子量為57 kDa的水溶性蕎麥蛋白,命名為TBWSP31[49]；其具有抑制人類乳腺癌細胞系生長的作用；進一步研究揭示，通過上調Fas和下調bcl-2,TBWSP31能誘導Bcap37細胞的凋亡[50-51]。因此,蕎麥蛋白質的抗癌作用有待進一步發掘。

7 討論

國內外對蕎麥蛋白活性肽的制備、純化、結構鑒定和生物活性的研究取得了很大進展,特別是蕎麥的胰蛋白酶抑制劑具有開發成醫藥制劑的潛在價值；同時,蕎麥蛋白和其水解的活性肽的降壓作用和降血脂特性已成為現在研究的熱點,所以,蕎麥蛋白質可以被作為功能型食品添加劑,治療心血管系統疾病。然而,吞食后的蕎麥蛋白在胃腸道的消化與降解條件目前還不是很清楚,因此,深入研究蕎麥蛋白的水解特性,發掘水解產物中具有特殊生物活性的小分子多肽,對有效利用蕎麥蛋白資源具有重要意義。