紙層析法分離葉綠體色素方法的低毒優化

呂亞慈

（衡水學院生命科學學院 河北 衡水 053000）

葉綠體色素是植物吸收太陽光進行光合作用的重要物質，主要由葉綠素a、葉綠b、胡蘿卜素和葉黃素組成。分離色素的方法有多種，如紙層析、柱層析等，紙層析是其中較簡單的一種，也是學生試驗中提取分離葉綠素的常用方法。但此方法使用較多的有毒試劑，如丙酮、CCl4等，存在層析時間長、分離效果較差等不足之處。所以，本文針對上述缺點對試驗進行優化。

1 試驗方法

影響葉綠體色素層析試驗效果主要有三個因素：對材料的處理、提取溶劑的選擇、層析劑的選擇。可以通過逐一改變其影響因素(其他的和對照組相同)的方法分別測出在這三個因素方面的最優良做法，從而獲得一個優化后的分離方法。

1.1 材料的處理。稱取新鮮、去大葉脈的菠菜葉，按2 g/組稱取3組，分別對這3組材料做以下處理：①直接研磨，不做任何處理(傳統做法，為對照組)。②投入沸水中(30～40 s)后，立即放入冷水中(數秒)，撈出后用吸水紙吸干水分[1]。③在烘箱內(48℃)烘干約半小時[2]，待材料處理好以后分別剪碎放入3個研缽中，加入少量的CaCO3(中和細胞中的酸，防止Mg2+從葉綠素中釋放)和石英砂進行研磨，成勻漿后再加入10 ml丙酮，然后用漏斗過濾，得到3瓶葉綠體色素提取液，并標號。后續采用相同的方法：圓形濾紙點樣，長7 cm、寬2 cm的濾紙條卷成紙捻，讓紙捻浸泡在CCl4+無水Na2SO4的層析液中進行層析，觀察試驗結果[3]。

1.2 提取液的選擇。合適的提取液能有效地提高色素的提取量，保證分離時會有好的效果。取去大葉脈的菠菜葉，按2 g/組稱取4組，剪碎并放入研缽中，加入少量的CaCO3和石英砂進行研磨，待成勻漿后，分別加入丙酮(傳統做法，為對照組)、乙醇、丙酮+石油醚(2滴)、乙醇+石油醚(2滴)，4種提取液均為10 ml，過濾，得到4種葉綠體色素液，并標號。經過點樣、層析等相同步驟后，觀察試驗結果。

1.3 層析液的選擇。合適的層析劑使色素帶的分布更清晰，也能節省試驗時間。本試驗設置了不同的層析液：①CCl4加少量無水Na2SO4，作為對照組。②石油醚和CCl4，其比例為2∶1。③石油醚和苯，其比例為3∶1。④石油醚與苯，其比例為2∶1。用傳統的方法處理4組材料，研磨成勻漿后，加入10 ml的丙酮，過濾，得到葉綠體色素液。點樣用上述4種不同層析液進行層析，標號并記時。

2 試驗結果

2.1 選擇最優的材料處理。利用分光光度計對3種色素提取液進行測量，根據Lambert-Beer定律計算葉綠素含量，其結果如下：處理1：A663=1.023；A645=0.361Ct=15.500 mg/L；處理2：A663=1.013；A645=0.363Ct=15.461 mg/L；處理3：A663=0.925；A645=0.328Ct=14.047 mg/L

從以上數據可以看出：兩組值中，處理1與處理2均較為接近，處理3最小；再結合層析得到的結果，可以判斷出處理1與處理2對葉綠素的提取量較大，而處理2更有利于黃色素的提取。所以，本試驗選擇處理2的方法。

2.2 選擇最優的提取液。通過觀察層析結果得出：①丙酮：分離效果較好但是時間較長，丙酮有劇毒。②乙醇：價格低但是效果差。③丙酮+石油醚：提取較多的色素，分離效果較好，層析時間短，但是丙酮有劇毒。④乙醇+石油醚：提取較多的色素，分離效果好，層析時間短，成本較低。試驗結論：在加了石油醚的提取液中，能提取出較多的色素，其中以黃色素最為明顯。雖然丙酮作為提取液的分離效果較好，但由于丙酮有毒，而乙醇替代丙酮后試驗效果也很不錯，最終本試驗選擇了乙醇+石油醚作為最佳的提取液。

2.3 選擇最適的層析液。試驗結果：①CCl4+無水NaSO4(對照)：層析效果一般且用時最長。②石油醚+CCl4：層析效果一般且用時較長。③石油醚+苯：效果較好，用時較短。④石油醚+苯：效果較好，用時最短。因此，在用石油醚和苯以2∶1比例混合作層析劑時，層析的時間最短、層析的效果也是最好的。

3 最優的試驗方案

通過本試驗，最終確定了一套從材料處理、提取液與層析劑的改進等方面較傳統方法更優化的分離葉綠體色素的方法，具體步驟如下：①稱取2 g去大葉脈的新鮮菠菜葉，將其投入沸水中30～40 s，撈出后立即放入冷水中，數秒后撈出，用吸水紙吸干水分。②將處理好的材料剪碎放入研缽中進行研磨，待研磨成勻漿后加入乙醇與2滴石油醚，共10 ml，過濾，得到葉綠體色素提取液。③點樣：用毛細吸管吸取提取液，在濾紙條的靠上方點上密集的點或劃細線，然后用電吹風吹干(或自然晾干)，重復點樣6～7次。④做紙捻：再將紙條卷成紙筒，用剪刀將下端沒有點樣的部分剪成小刷子狀，做成紙捻。⑤層析：將做好的紙捻分別插入到已在圓心處開好孔的圓形濾紙上，以石油醚和苯2∶1比例的混合液作為層析劑，進行層析，19～23min后層析結束，得到清晰的色帶。