含纈氨酸蛋白p97與宮頸癌相關性的研究進展

楊文艷 ，賀桂芳 ，卞美璐

（1.北京大學醫學部，北京 100191；2.中日友好醫院 婦產科，北京 100029）

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤，在宮頸癌細胞也觀察到了p97蛋白陽性表達升高。隨著近年來對其深入研究，p97蛋白成為腫瘤治療的新靶點，研究表明，含纈氨酸蛋白p97與多種惡性腫瘤的發生發展、遠處轉移及預后相關，p97蛋白參與眾多生理病理過程，主要通過清除細胞內的異常蛋白質，控制蛋白質質量，維持正常細胞及腫瘤細胞存活[1，2]。p97抑制劑在治療婦科惡性腫瘤方面有其獨特的應用。本文就p97蛋白與宮頸癌的相關性研究進展進行綜述，以期為宮頸癌的預防和治療提供更多參考。

1 含纈氨酸蛋白p97的概述

1.1 p97蛋白結構

1982年，Moir等人首次描述了p97蛋白的酵母變異株，并認為其失活后導致細胞周期停止在G2-M期，在哺乳動物體內存在同源蛋白，因其分子量為97kDA，命名為p97蛋白或含纈氨酸蛋白[1]。隨后，在秀麗隱桿線蟲體內發現p97同源基因CDC-48.1和CDC-48.2，而在人類、鼠類和酵母等生物體內則是單個基因，在人體內，編碼p97蛋白的基因位于染色體9p13-p12，有報道前體B淋巴細胞轉錄因子是調節p97基因轉錄的關鍵因子[2]。

p97蛋白是一種同質六聚體，每個單體有1個N域和2個ATP酶域：D1域和D2域。低溫電子顯微鏡下觀察到，當D1域與ATP結合時，N域向上旋轉形成 “上方構象”，有利于N域與輔助因子結合，如與Ufd1/Npl4復合體形成泛素鏈底物結合位點，暴露的D2酶域增強ATP酶活性，ATP酶水解促使底物通過蛋白中心孔[3]。

1.2 p97蛋白功能

p97蛋白屬于ATP酶家族，它廣泛存在于人體各種細胞內，具有控制蛋白質質量、調控基因表達、調節轉錄活性、介導膜融合、參與細胞周期控制等多種功能。p97蛋白的功能依賴于結合不同的蛋白質輔助因子，例如，p97結合Npl4/Ufd1調節泛素蛋白酶系統，p97蛋白結合UBXD1主要影響溶酶體功能，p97結合p37主要發生在內質網、高爾基體上[4]。

p97蛋白介導降解異常蛋白控制細胞內蛋白質質量：（1）p97介導胞內錯誤折疊蛋白質泛素化，并協助其通過脂質雙分子層，由內質網轉運到蛋白酶體，完成內質網相關的蛋白降解；（2）有缺陷的mRNA翻譯產生異常多肽，底物泛素化，泛素化底物與p97蛋白結合，提取異常多肽至溶酶體降解；（3）p97結合線粒體外膜異常多肽，促進線粒體相關的降解，維持線粒體內蛋白質穩態；（4）p97參與細胞自噬，當線粒體受損時，p97與Ufd1/Npl4被招募到線粒體表面，通過細胞自我吞噬清除線粒體，具體機制可能與蛋白 Vmsl、Ufd3 有關[1]。

另外，p97調控基因表達，p97通過泛素蛋白酶系統降解小抑制蛋白質IκB，提高NFκB活性。p97能夠從染色質中提取不同的泛素化蛋白，協助復制，p97與Ufd1結合將Ku環從DNA鏈上移除，還與泛素連接酶RNF138協同誘導無錯同源重組，控制修復的精準度[6]。

2 p97蛋白與宮頸癌

2.1 p97蛋白與宮頸癌的發生發展

研究發現正常宮頸組織、CIN2/CIN3、宮頸癌組織中p97蛋白含量具有統計學差異，在絕大多數正常組織中低表達，在CIN2/CIN3及宮頸癌中高表達，進一步采用免疫組化方法證實，p97蛋白在宮頸癌的陽性表達明顯高于正常組織[7]，這表明p97蛋白的表達升高可能與宮頸癌的發生有關。

有報道采用可逆性p97蛋白抑制劑N2，N4-二苯基喹唑啉-2，4-二胺（DBeQ）作用于宮頸癌細胞（HeLa），細胞中p97蛋白耗盡時，細胞核和膜豐富的區域聚集大量轉錄因子，腫瘤細胞凋亡[2]。在正常組織細胞內，p97蛋白介導泛素蛋白酶系統及時清除異常蛋白，控制細胞內蛋白質質量，在癌細胞內，由于細胞周期加快，蛋白質的合成速度也非常快，產生的“殘次品”也越多，癌細胞的生長和存活更加依賴p97蛋白來進行蛋白質的“質量控制”，抑制p97蛋白誘發腫瘤細胞內異常蛋白堆積，導致腫瘤細胞死亡，提示p97蛋白對宮頸癌細胞生存有著重要作用。

2.2 p97蛋白與宮頸癌復發轉移

關于p97蛋白在惡性腫瘤復發轉移過程中的分子機制研究，有報道使用siRNA干擾p97蛋白表達或者應用p97蛋白抑制劑EeyarestatinI（EerI）能促使細胞發生內質網應激和上皮細胞間質轉型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）樣改變[9]。EMT是指上皮細胞丟失表面標記物獲得間葉細胞表面標記物，是腫瘤發生侵襲的重要機制。細胞內異常蛋白質不及時清除導致內質網應激，內質網應激可通過多種通路促使EMT，例如，在肺泡上皮細胞中的MAPK、Smad及β-連環蛋白。

p97蛋白調節NFκB活性參與細胞增殖、抗凋亡過程，NFκB正性調節細胞因子IL-6、IL-8、VEGF，影響腫瘤血管生成，NFκB還可活化MMP9和尿激酶樣纖溶酶原激活劑，后兩者與腫瘤細胞遠處轉移密切相關。

研究報道，p97蛋白與多種惡性腫瘤的遠處轉移有關。國外報道170例肝癌組織中，p97蛋白高表達的肝癌患者具有較高的門靜脈侵犯潛能（P＜0.01），國內13例肝細胞癌肉眼癌栓和鏡下肝細胞癌栓的病例中12例（92.3%）p97陽性表達。非小細胞肺癌浸潤轉移組中p97蛋白的陽性表達率為90%（18/20）、非轉移組52%（21/40），差異具有統計學意義（P=0.002）[10～12]。14 例發生遠處轉移的骨肉瘤組織中p97蛋白高表達11例 （78.6%），46例無轉移的骨肉瘤組織中p97高表達15例（32.6%），二者統計學差異顯著（P=0.01）[13]。檢測421例乳腺癌腫瘤組織中和正常乳腺組織p97蛋白含量，發現兩者具有統計學差異（P＜0.01），隨訪結果顯示p97蛋白高表達導致乳腺癌患者低生存率[14]。p97蛋白低水平表達的前列腺癌患者5年生存率明顯高于p97蛋白高水平表達者，并且p97蛋白水平與血清PSA水平呈正相關，血清PSA是目前預測前列腺癌復發轉移的主要指標，PSA＞20ng/ml在p97蛋白低表達者占25.8%，在p97蛋白高表達者占67.7%[15]。目前，尚無p97蛋白與宮頸癌遠處轉移的報道，其與宮頸癌復發轉移的相關性有待進一步研究。

2.3 p97蛋白與人乳頭瘤病毒（HPV）感染

高危型HPV持續感染并整合到宿主細胞染色體上是宮頸癌發生的關鍵，當病毒入侵時，宿主細胞通過啟動凋亡程序抑制病毒增殖。HPV E6蛋白與泛素連接酶結合，誘導p53泛素化并被溶酶體降解，抑制細胞凋亡；HPV E7蛋白與Rb結合，促進宿主細胞進入S期，促進細胞有絲分裂。有研究報道[16]，p97啟動子與HPV的轉化有關，在宮頸癌細胞中，p97啟動子上調HPV16 E6/E7 mRNA和蛋白的表達，并且p97通過E6-E6 APPTPN3通路調控HPV E6基因表達。

有學者采用RT-qPCR技術[17]，研究23例CIN2和CIN3、16例子宮頸鱗癌標本p97與p14轉錄差異，證實在宮頸癌和高級別上皮內瘤變組織中，P14轉錄明顯低于p97轉錄，但兩者在上皮內瘤變和宮頸癌組織中的表達均具有統計學差異，提示p97啟動子控制大部分HPV病毒早期基因的轉錄。另一項研究利用免疫組化的方法，分析p97蛋白在口咽鱗癌組織中表達差異性，發現p97蛋白高表達的HPV陰性患者的5年生存率明顯高于p97蛋白低表達者，而HPV陽性患者5年生存率與p97蛋白表達不相關。進一步采用qPCR分析15例HPV陰性口咽癌細胞，具有9p13-p12區域的細胞p97表達明顯高于缺失此區域的細胞，而HPV陽性口咽癌患者中，9號染色體的缺失與較好的預后相關，在HPV陰性患者中9號染色體的缺失預后更差[18]，而p97基因位于9號染色體上。提示9p13-p12區域的丟失、p97 mRNA轉錄減少、蛋白表達降低和HPV陰性口咽癌不良預后有直接相關性。

3 p97蛋白抑制劑與惡性腫瘤治療

3.1 p97蛋白抑制劑的研究

p97蛋白參與多種病理生理過程，與腫瘤的發生發展及預后相關[19]，p97蛋白抑制劑作為抗腫瘤藥物具有良好的臨床應用價值。人工合成p97蛋白抑制劑EerI，它主要針對p97蛋白D1域ATP水解功能，但不具有特異性。研究證實EerI主要通過聚集多泛素化蛋白、抑制內質網相關的蛋白降解、誘發內質網應激和細胞凋亡等途徑抑制p97蛋白功能，在體外，EerI有明顯的腫瘤殺傷活性，它能增強蛋白酶體抑制劑Bortezomib的殺傷宮頸癌細胞作用[20]，這提示我們p97蛋白有望成為新的抗腫瘤靶點。

近年來，對p97蛋白抑制劑的研究更加深入，DBeQ是一種可逆性抑制p97蛋白化學制劑，它特異性作用于p97蛋白D2域，具有較高的殺傷宮頸癌細胞活性[8]。其中最有名的可逆性p97蛋白抑制劑是CB-5083，它選擇性作用于D2域，競爭性抑制ATP酶活性，具有良好的口服生物利用率。實驗證實，無論是實體細胞腫瘤還是血液系統腫瘤，在異種腫瘤移植的小鼠體內，CB-5083能持續發揮抗腫瘤活性，目前，CB-5083的研究已經進入Ⅰ期臨床試驗階段[21]。

然而，上述人工合成的p97蛋白抑制劑作為抗腫瘤藥物進入臨床帶來了新的問題：腫瘤細胞產生抗藥。學者探討腫瘤細胞產生抗CB-5083的分子機制[22]，采用卵巢癌細胞接受較高濃度CB-5083處理方法，獲得抗藥性比母系高5～6倍的卵巢癌細胞，分析p97編碼序列的基因組和互補DNA序列發現：（1）密碼子470的錯義突變導致p97蛋白ATP酶活性增強；（2）密碼子606或密碼子616的無義突變或者移碼突變導致特異等位基因沉默。這些與卵巢癌細胞抵抗p97蛋白抑制劑有關的突變可能有利于臨床試驗中尋找潛在的輔助標記物，針對p97突變點的靶向治療有助于提高p97抑制劑抗腫瘤效果，p97蛋白抑制劑有望成為抗腫瘤治療方案之一。

研究發現，長期持續服用戒酒藥雙硫侖的乳腺癌患者，相比于沒有使用雙硫侖的患者，死亡率降低了34%[23]。臨床隨機對照研究發現，加用雙硫侖藥物治療晚期非小細胞肺癌相比單純化療，患者生存時間延長10～7.1個月[24]。最近，Nature雜志首次揭示了雙硫侖代謝產物二硫代氨基甲酸酯-銅復合體（diethyldithiocarbamate-copper complex，CuET）是發揮抗腫瘤作用的主要物質，CuET主要作用于p97-NPL4介導的泛素蛋白酶體降解途徑，抑制p97蛋白功能，使癌細胞內積累大量的殘次蛋白，誘發熱休克反應，最終導致癌細胞的凋亡[25]。p97蛋白成為抗腫瘤研究的熱點。

3.2 p97蛋白抑制劑在宮頸癌治療中的應用

目前，宮頸癌的治療主要是手術治療和放射治療，手術治療僅適用于Ⅰa～Ⅱa期患者，其效果受患者臨床分期、年齡、全身情況、設備條件及醫療技術水平影響，手術屬于有創操作，術中術后并發癥多，如臟器損傷、出血、輸尿管瘺、膀胱陰道瘺、淋巴囊腫及術后感染等，嚴重影響患者婚姻質量和生命質量。放療是治療婦科惡性腫瘤的常用手段之一，當手術切除范圍不夠、手術有可疑局部殘存且該腫瘤具有放療敏感性時，可行術后輔助性放療，放療的不良反應多，包括骨髓抑制、納差、腹瀉、泌尿系不適等，降低患者生命質量，影響患者依從性。基于雙硫侖具有抗腫瘤作用的研究，有學者研制含有雙硫侖藥物的陰道環劑治療宮頸癌[26]，采用乙烯-醋酸乙烯酯共聚物材料，雙硫侖穩定性良好，并且能可控性地釋放使其維持在宮頸癌HeLa細胞半抑制率以上的濃度進一步。也有學者研制雙硫侖陰道片，雙腔陰道片在體外釋放持續釋放雙硫侖，Elvax 40陰道制劑超過14天仍每天釋放15.4μM雙硫侖，使其濃度達宮頸癌細胞半抑制率的2500至3500倍[27]。提示p97蛋白抑制劑可能為宮頸癌的治療提供新的途徑。

4 展望

p97蛋白是細胞眾多病理生理過程中重要的調控分子，與惡性腫瘤的發生發展、預后密切相關，目前對p97蛋白作用機制的研究取得了很大進展，但其對宮頸癌病情發展、預后評估的作用機制尚不清晰，仍需進一步研究。對p97蛋白的清除細胞內異常蛋白控制細胞內蛋白質質量及細胞凋亡作用、參與HPV早期感染的深入研究，有助于推動p97蛋白抗宮頸癌靶點作用機制的研究，在基因靶向治療宮頸癌方面具有良好前景。