多基因檢測在綜合性醫院分枝桿菌分型中的臨床應用

楊 輝，賈紅兵，李 江，周誠君，王 靖

（中日友好醫院 檢驗科，北京 100029）

分枝桿菌已報道150余種[1]，除了麻風分枝桿菌 （mycobacterium，leprae）和結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）） ，其余統稱為非結核分枝桿菌 （non-tuberculous mycobacterium，NTM）。NTM肺病與結核病有著類似的臨床表現，常被誤診為肺結核。近年來，NTM的分離率和發病率呈上升趨勢[2]。以分枝桿菌培養及抗酸染色鏡檢為基礎的傳統方法不能有效區分MTB與NTM。另外，諾卡菌屬易與NTM混淆[3]。

DNA測序是核酸診斷的“金標準”，隨著成本降低，測序將成為微生物核酸檢測的常規選項。16S rDNA是是細菌分類研究中最常用的靶序列。分枝桿菌rpoB基因編碼RNA聚合酶β亞基，與hsp65（heat shock protein 65）基因一起作為靶基因在分枝桿菌型屬鑒定中得到廣泛應用[4，5]。本研究旨在利用核酸檢測技術，篩查綜合性醫院臨床分離的分枝桿菌并鑒別菌種。使用16S rDNA基因來篩查分枝桿菌，我們使用rpoB基因來鑒定分枝桿菌菌種，以hsp65基因進行復核。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

2015年10月～2016年9月，我院需診斷或除外肺結核的患者留取痰樣本4467份，排除重復檢測，關聯至就診者2236例，其中抗酸陽性者40例。經改良L-J培養基37℃培養2～8周，菌落涂片經萋-尼氏染色，鏡檢陽性的菌落經16SrDNA測序排除諾卡菌及其他非目的菌，獲得32例分枝桿菌臨床分離株。

1.1.2 主要試劑和儀器

改良羅氏培養基購自濟南賽爾生物公司；Blend Taq plus DNA聚合酶購自日本Toyobo公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；溴化乙錠購自美國Sigma公司；ABI 9700 PCR儀購自美國應用生物信息公司；Gel Doc 2000凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA樣本制備

參考萬康林團隊的研究文獻[6]，在生物安全柜中用接種環刮取細菌，置于100μl的TE液中混勻，金屬浴 80℃滅活 60min，100℃加熱 30min，立即置于冰上2min，12000r/min離心3min，移上清置-20℃凍存備用。

1.2.2 DNA擴增及測序

參考前人的研究方法[3，6，7]，比較核酸診斷分枝桿菌的種屬特異性保守序列，選擇16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因作為本研究的靶序列，PCR引物由上海生工公司合成（見表1）。PCR反應體系為 30μl，取 10×含鎂的緩沖液 3μl，2.5 mmol/L 的 dNTPs （dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP）3μl，10μmol/L 引物各 3μl，模板 DNA 3μl，Blend Taq plus DNA聚合酶1U，最后加滅菌水至終體系30 μl。PCR 循環參數：94℃預變性 5min，94℃變性30s，60℃ 延伸1min，共反應35個循環，最后72℃ 延伸 5min。擴增后取5μl PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳后用溴化乙錠（EB）染色10min，并在凝膠成像系統上觀察分析。

1.2.3 PCR產物測序分析

PCR產物由北京睿博生物公司進行測序。16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因3個靶序列信息上傳 NCBI 網站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），進行同源性比較分析。序列同源性＞97%者即可確定菌型。

2 結果

2.1 菌株篩選

2015年10月～2016年9月，中日友好醫院微生物實驗室L-J培養基分離菌落149株，萋-尼氏抗酸陽性者經16S rDNA測序確認為分枝桿菌32株，均分離自不同的臨床患者痰樣。

表1 引物序列

圖1 rpoB與hsp65 PCR產物測序前電泳

2.2 分枝桿菌分型

32株分枝桿菌核酸擴增完成后，產物電泳確認（見圖1），經rpoB基因序列分析，包括結核分枝桿菌22株，分離率為68.8%，非結核分枝桿菌10株，分離率為31.2%。10株NTM菌株中，包括膿腫分枝桿菌4株，胞內分枝桿菌3株，海分枝桿菌1株，龜分枝桿菌1株，產黏液分枝桿菌1株。hsp65基因測序結果與rpoB基因測序結果完全一致。

3 討論

肺結核初診初查大多是由綜合性醫院完成，但是因為生物安全或結核專力量不強等原因，綜合性醫院實驗室分枝桿菌鑒定分型方法未能普遍開展，導致綜合性醫院分枝桿菌研究相對稀缺。如果預先對樣本進行菌體滅活，然后提取核酸可以減少生物危害，所以應用相對安全的核酸診斷技術，可成為綜合型醫院今后結核病篩查、診療工作的重點之一。

本研究使用了rpoB基因與hsp65基因進行分枝桿菌菌種鑒定，結果完全一致，但hsp65基因擴增效率較低，其中5株菌進行了二次PCR擴增。其原因可能與我們的核酸樣本制備的方法有關。考慮到濕熱容易使分枝桿菌滅活，操作須在安全柜內操作，所以我們使用了最簡易的生物安全柜內熱裂解法。這樣制備的DNA比較破碎，hsp65基因PCR產物片段大，完整的核酸模板數量少，擴增效率低于rpoB基因。

本研究分支桿菌的NTM分離率為31.2%，遠高于國內同時期結核病專科醫院的研究數據，福州肺科醫院 NTM 分離率為 10.2%（649/6362）[6]，上海肺科醫院NTM分離率為 10.8%（95/877）[7]，新疆自治區胸科醫院NTM分離率為4.98%（183/3674）[8]，沈陽市胸科醫院NTM分離率為1.87%（72/3847）[9]，重慶公衛醫療救治中心NTM分離率為10.23%（58/567）[10]。數據的差異與分支桿菌的地理分布和實驗室檢測手段有關[11，12]，但現行的結核病防治模式也會對之產生影響。因此在綜合醫院提高分枝桿菌檢測水平，是規范結核病診療的重要環節。