高效液相色譜法測定黑茶中咖啡因含量分析

□ 黃燚娜 東莞捷榮食品有限公司

茶作為一種傳統飲品，長期飲用有非常好的降血脂、減肥效果，由此得到關注。相關研究表明，茶葉之所以有減肥功效，是其中包括活性成分，即茶多酚、咖啡因，進入到人體內會形成協同作用，加速機體代謝，從而達到減肥的效果。尤其是黑茶，黑茶中有500余種化合物，補充人體所需元素，例如維生素、蛋白質、氨基酸等，有極高的營養價值。但是，若服用過量的咖啡因，也會對人體的中樞神經系統形成刺激，出現中樞神經系統興奮現象，甚至會中毒。為此，本文主要使用高效液相色譜法測定黑茶中所含有的咖啡因含量，以此來更好地認知黑茶。

1 試驗試劑與儀器

1.1 材料與試劑

本次試驗需要用到黑茶樣品、咖啡因標準品、甲醇、乙醇、分析純、二甲基甲酰胺以及二次蒸餾水。

1.2 儀器

試驗所需儀器包括液相色譜儀、超聲波清洗器以及Kromasil C18的色譜柱。

2 試驗過程

組織試驗主要有以下三個環節。

2.1 處理樣品

首先，使用粉碎機將選定的黑茶樣品進行粉碎處理，并且用篩子過濾，將大于0.45 mm的黑茶剔除。稱量黑茶樣品1.0 g，將其放到燒杯內，隨后加入0.5 g的MgO與30 mL的二次蒸餾水，燒杯放在沸水浴內浸提，時間為20分鐘，期間需要間隔5分鐘進行一次振蕩[1]。20分鐘結束之后要馬上將溶液進行減壓過濾，待其冷卻到室溫之后，轉移至50 mL的容量瓶內，以二次蒸餾水進行定容處理。定容至50 mL之后需要從中移取10 mL，將其進行超聲脫氣處理，時間為5分鐘，使用混纖維孔濾膜進行過濾，將最后5 mL保留，準備測定。

2.2 制備咖啡因標樣溶液

稱量17 mg的咖啡因樣品，將其放置在容量為50 mL的燒杯內，將甲醇和水按照70∶30的比例混合后放置在燒杯內將咖啡因樣品溶解，從而完成咖啡因標樣溶液配制。

2.3 色譜設置

本次試驗選擇的色譜柱為Kromasil C18，隨后便可以設置流動相，即水-甲醇-乙酸-二甲基酰胺，其配置比例為70∶30∶0.05∶0.25。色譜柱溫設置為25 ℃，檢測器選用紫外檢測器，檢測和掃描波長分別為274 nm、210～400 nm。

3 試驗結果

3.1 樣品中咖啡因含量檢測

對本次試驗所有樣品進行檢測，基于設置的色譜條件保證每種樣品進樣次數為3次，以此計算積分峰面積平均數值以及所有樣品中所含有的咖啡因含量，最后結果如下：茯茶中含有7.295 mg/g咖啡因，新生普洱茶中含有19.92 mg/g咖啡因，新熟普洱茶含有28.0575 mg/g咖啡因，沱茶含有18.725 mg/g咖啡因。

將已經制備好的咖啡因標樣溶液放置在10 mL的容量瓶內，溶液分別取0.5、0.9、1.3 mL，再以甲醇和水將溶液進行定容。超聲脫氣處理5分鐘，隨后使用混纖維濾膜進行溶液過濾[2]。確定進樣量，即5 μm，積分峰面積和咖啡因質量濃度分別當作橫坐標與縱坐標，通過試驗所得數據繪制標準曲線，并確定標準曲線的回歸方程，即Y=6×10-8X+0.0044。

3.2 樣品精密度檢測

試驗過程中需要稱取1.0 g的樣品，并且對樣品進行處理，將其制備成4個質量濃度溶液，各個濃度的溶液分別進行多次檢測，以最終結果為精密度計算依據[3]。本次試驗精密度檢測結果如下：① 樣品質量濃度是0.018 mg/mL，測定值在0.015 86～0.016 82 mg/mL，檢測平均值是0.016 53 mg/mL，標準偏差是0.000 66 mg/mL，變異系數為3.98%；② 樣品質量濃度是0.033 mg/mL，測定值在0.029 62～0.030 28 mg/mL之間，檢測平均值是0.030 55 mg/mL，標準偏差是0.001 2 mg/mL，變異系數為3.68%；③ 樣品質量濃度是0.048 mg/mL，測定值在0.043 62～0.044 51 mg/mL，檢測平均值是0.043 96 mg/mL， 標 準偏 差 是0.000 69 mg/mL，變異系數為1.66%；④ 樣品質量濃度是0.055 mg/mL，測定值在0.053 91～0.056 86 mg/mL，檢測平均值是0.055 46 mg/mL，標準偏差是0.000 61 mg/mL，變異系數為0.61%。

3.3 咖啡因樣品回收率

完成以上試驗之后，依然要稱取1.0 g的咖啡因樣品，并進行樣品制備與處理，將其配制成3種濃度的溶液，并且加入1.0 mL的咖啡因標準品溶液，隨后均勻混合，進行超聲脫氣處理，利用混合纖維膜處理之后開始進樣檢測。檢測最終顯示回收率在91.25%～104.4%[4]。

4 結論

首先，在黑茶內所含咖啡因提取溶劑的試驗過程中，主要是對黑茶水泡與咖啡因二者可溶于乙醇這一特點進行觀察，將黑茶與水、濃度分別為50%、70%以及90%的乙醇溶液混合，將超聲時間設置為30分鐘，計算咖啡因樣品的峰面積。試驗顯示，濃度為50%的乙醇溶液當中黑茶內含有的咖啡因含量比較大，所以咖啡因含量測定試驗建議選擇濃度為50%的乙醇溶液當作提取溶劑。

其次，需要選擇合適的檢測波長，以此為色譜分析奠定基礎。相關研究表明咖啡因檢測波長存在很大差異，所以試驗高效液色譜二極管陣列檢測器作為試驗器具，明確最為合適的檢測波長。試驗過程中，二極管陣列檢測器中的波長掃描范圍將其設置在190～400 nm，將已經完成配制的溶液注入針孔注射器中，通過0.45 μm濾頭進行過濾，隨后開始波長掃描。盡管201.7 nm 位置的吸收值相對來說比較大，但是因為一些物質中含有末端吸收，所以該波長的咖啡因色譜峰便會受到雜質峰影響，盡管271 nm的吸收值小，然而卻有非常大的專屬性，不會造成干擾，所以可以將其作為咖啡因特征吸收峰。由此，建議確定271 nm為檢測波長。

最后，測定黑茶內的咖啡因含量會受諸多因素影響，例如：黑茶的品種以及制作條件等，所以每個地區的黑茶所含有的咖啡因也不盡相同。對比黑茶發現，每個品種的黑茶含有的咖啡因不同，為此可以采集更多的樣本，對其中的咖啡因含量進行測定。

通過分析可知，此次試驗所使用的高效液相色譜法在黑茶內咖啡因含量的測定中，最終結果準確性高，且操作過程靈活、簡便，還體現出極強的專屬性，適合用于黑茶中咖啡因含量定量測定。