DPPH法測定蓮蓬原花青素清除自由基能力研究

□ 吳佳紅 王建美 金華職業技術學院 姚周平 金華眼科醫院 葛彬潔 林小柯 金華職業技術學院

自由基引發的過氧化作用不僅是食品營養和味道變劣的一個重要原因，而且與關節炎、心腦血管疾病、衰老、腫瘤及炎癥等許多病理、生理現象相關。大量證據表明，病理生理狀態下氧自由基的慢性或急性過度產生可誘發或加重心腦血管疾病；抗氧化物質通過減少自由基的產生實現有效克服過量自由基所帶來的危害。原花青素是目前國際上公認最有效的清除人體內自由基的天然抗氧化劑，其清除自由基能力和抗氧化作用是維生素E和維生素C的數十倍，能預防和治療80多種因自由基引起的疾病，同時也能改善人體微循環[1-2]。

蓮蓬是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物蓮（Nelumbo nuciferaGraertn.）的成熟花托。國內外研究表明，蓮蓬中含有較為豐富的原花青素。本研究以蓮蓬中提取分離的原花青素為研究對象，通過DPPH法測定其抗氧化清除自由基能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需儀器有721型紫外可見分光光度計、HH-2數顯恒溫水浴鍋、EYELA SB-1100旋轉蒸發儀、SB30001電子天平、JHBE-50T閃式提取器及101型電熱恒溫干燥箱。試驗所需試劑有原花青素標準品、DPPH·標準品、XB大孔吸附樹脂、維生素C，還有香草醛、濃鹽酸等試劑（均為分析純）。蓮蓬采摘于浙江省金華市武義，經金華職業技術學院鑒定為睡蓮科蓮屬植物蓮。

1.2 試驗方法

1.2.1 DPPH·標準曲線的制作

精密稱定DPPH·標準品7.5mg，甲醇定容至100mL，配成質量濃度為75μg/mL的標準溶液，置于冰箱中保存備用（現配現用）。分別取0、1、2、4、8 mL和10mL標準溶液，甲醇定容至10mL，515nm波長處測其吸光度。

1.2.2 蓮蓬提取物制備

采用閃式法[3-4]制備蓮蓬提取物。將新鮮蓮蓬用恒溫干燥箱烘干，接著粉碎過40目篩，準確稱取該干蓮蓬粉入提取罐，按料液比1∶24加60%乙醇提取液，稱重，閃式提取2min，放冷，再稱重，用提取液補足減少的質量，搖勻，過濾，濾液經旋轉蒸發儀濃縮，得蓮蓬提取物干粉。

1.2.3 蓮蓬提取物中原花青素含量的測定

稱取一定量蓮蓬提取物干粉，加甲醇溶液配置成蓮蓬提取物甲醇溶液，取1mL該溶液于10 mL試管中，依次加入3%香草醛-甲醇溶液3mL和濃鹽酸溶液1.5mL，搖勻，在25℃下顯色30min。以甲醇溶液為空白對照，λ=500nm處紫外可見分光光度計測吸光度。根據原花青素標準曲線的回歸方程計算蓮蓬提取物中原花青素得含量為85.6%。

1.2.4 自由基清除率測定試驗

精密稱定蓮蓬原花青素粉末，甲醇為溶劑，配制成不同濃度的蓮蓬原花青素液作為試驗組，分別取0.2mL樣液，加入2.6mL75μg/mL的DPPH·標準液，以甲醇作為空白對照。同時，配制等濃度的維生素C作為對照。將混合液搖勻，在515nm處測定其在不同時間的吸光度值，根據1.2.1項下的標準曲線換算成[DPPH·]的質量濃度，從而計算出[DPPH·]的殘留率。根據該殘留率和相應的蓮蓬原花青素添加量，可以繪制蓮蓬原花青素清除[DPPH·]自由基的曲線，通過線性回歸分析可得到兩者的回歸方程。添加自由基清除劑后的DPPH·殘留率計算公式如下：

式（1）中，[DPPH·]REM為添加自由基清除劑后的DPPH·殘留率，[DPPH]T=0為DPPH·的原始質量濃度，[DPPH·]T為自由基清除過程中某時的DPPH·質量濃度。

1.2.5 半抑制量（EC50）的計算和清除自由基能力（AE）的評價

根據蓮蓬原花青素清除DPPH·自由基的曲線所得的回歸方程，計算得到[DPPH·]的原始質量濃度減少至50%時蓮蓬原花青素的添加量。自由基清除能力AE=1/EC50。根據AE值判斷抗氧化劑清除自由基的能力大小，其值越大表明抗氧化劑清除自由基能力越強。

2 結果與分析

2.1 DPPH·標準曲線

根據1.2.1項下得到的數據，以溶液濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪得標準曲線（見圖1）。其線性回歸方程為A=0.0195C+0.0092，R2=0.9995。

2.2 蓮蓬提取物自由基清除率

DPPH·溶液中加入各濃度蓮蓬提取物溶液約15min后，DPPH·溶液的吸光度不再改變，反應完全，記錄該時的測定值Ai和Aj，見表1。

2.3 維生素C自由基清除率

DPPH·溶液中加入各濃度維生素C溶液（對照品）約15min后，DPPH·溶液的吸光度不再改變，反應完全，記錄該時的測定值Ai和Aj，見表2。

圖1 DPPH·標準曲線

表1 蓮蓬提取物對DPPH自由基的清除率

表2 維生素C對DPPH自由基的清除率

2.4 蓮蓬提取物組和維生素C組抗氧化活性對比

根據蓮蓬提取物添加量與DPPH·清除率的關系，繪制關系曲線并回歸分析得回歸方程，再利用SigmaPlot軟件計算得出蓮蓬提取物清除DPPH·的EC50為107.2g/kg，AE為0.0093，維生素C清除DPPH·的EC50為130.3g/kg，AE為0.0077。

3 討論

DPPH法是判定藥物體外抗氧化活性的經典方法。本研究結果表明隨著蓮蓬提取物劑量的增加，DPPH·清除率相應增加，且成劑量依賴關系，這說明蓮蓬原花青素與DPPH·在反應初期結合生成DPPH-PheO，消耗DPPH·，降低DPPH·的含量。而當蓮蓬提取物用量在0.125mg/mL以上時，DPPH·的含量不再相應降低。這可能是DPPH·減少到一定程度時會出現原花青素中的羥基和DPPH·相互競爭生成PheO-PheO，從而抑制原花青素與DPPH自由基的結合所致[5]。

本試驗結果顯示，DPPH法可以用于蓮蓬原花青素抗氧化能力的測定。蓮蓬提取物抗氧化清除自由基能力大于維生素C。蓮蓬提取物和維生素C的清除DPPH·的半抑制量EC50分別為107.2、，130.3g/kg，其清除自由基的能力AE分別為0.0093、0.0077。