膠體金免疫層析法快速檢測(cè)食品中呋喃妥因及其代謝物殘留

張亞琴 陳月琴

【摘 要】本文采用膠體金免疫層析技術(shù)測(cè)定測(cè)定食品中的呋喃妥因及其代謝物殘留，結(jié)果顯示膠體金免疫層析法的檢測(cè)限為0.5μg/kg，假陽(yáng)率不大于5%，假陰率為0，研究表明膠體金試紙條法操作簡(jiǎn)便、快速、成本低，是食品中呋喃妥因代謝物的殘留檢測(cè)提供了快速篩選方法。

【關(guān)鍵詞】食品安全；硝基呋喃妥因類代謝物；前處理方法；結(jié)果判讀

中圖分類號(hào)： O657.63；TS207.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）27-0223-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.27.103

【Abstract】In this paper， the determination of nitrofurantoin and its metabolite residues in food was determined by colloidal gold immunochromatography. The results showed that the detection limit of colloidal gold immunochromatography was 0.5μg/kg， the false positive rate was not more than 5%， and the false negative rate was 0. Studies have shown that the colloidal gold test strip method is simple， rapid， and low-cost， and provides a rapid screening method for residue detection of nitrofurantoin metabolites in aquatic products.

【Key words】Food safety；Nitrofurantoin metabolites；Pretreatment methods；Results interpretation

0 引言

硝基呋喃類藥是治療人類和動(dòng)物疾病的廣譜性合成抗菌藥，其價(jià)格低廉，被廣泛使用，但由于它的強(qiáng)毒性和致癌的副作用，引起了世界各國(guó)的高度重視。這些物質(zhì)無(wú)論在動(dòng)物源性食品中殘留多少，均會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康帶來(lái)長(zhǎng)久的危害，故該類藥物在動(dòng)物源性食品中是嚴(yán)格禁止使用的。

在1995年，歐盟發(fā)布指令禁止在食用動(dòng)物中使用四類硝基呋喃類藥物，我國(guó)在2002年發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》中也已經(jīng)明令禁止硝基呋喃類藥物。故對(duì)于呋喃類物質(zhì)代謝物的研究和檢測(cè)的意義就顯得更為重要，同時(shí)開(kāi)發(fā)該藥在食品中靈敏、穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)方法就顯得非常必要。

作為現(xiàn)代四大標(biāo)記技術(shù)之一的膠體金標(biāo)記技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。近年來(lái)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督等各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。本文采用膠體金免疫層析技術(shù)測(cè)定測(cè)定食品中的呋喃妥因及其代謝物殘留，結(jié)果顯示膠體金免疫層析法的檢測(cè)限為0.5μg/kg，假陽(yáng)率不大于5%，假陰率為0，研究表明膠體金試紙條法操作簡(jiǎn)便、快速、成本低，為水產(chǎn)中呋喃妥因代謝物的殘留檢測(cè)提供了快速篩選方法。

硝基呋喃類藥物大多為黃色結(jié)晶，難溶于水和植物油，微溶于乙醇和氯仿中，較易溶于二甲基甲酰胺。實(shí)驗(yàn)時(shí)欲配置一定濃度的水溶液，可先將其溶解于二甲基甲酰胺中，再用水稀釋即可。硝基呋喃類藥物的溶液在光照下易分解，故保存時(shí)其溶液或粉末均以避日光和熒光的照射為宜。

1 試劑的配置和樣品的制備

1.1 試劑的配置

呋喃A：1份濃鹽酸加35份水。

呋喃B：3.778克2-硝基苯甲醛用二甲亞砜定容至500mL，置于棕色瓶中。

呋喃C：1121.1克KH2PO4.3H2O溶于水，定容至5L，得濃縮液，按體積比，將1份濃縮液加入9份水混合均勻得呋喃C。

呋喃D：取80克NaOH，定容至1L，得濃縮液，按體積比，將1份濃縮液加入4份水混合均勻得呋喃C。

呋喃E：425克NaCl、277.15克KH2PO4.3H2O、13克KH2PO4.3H2O、25mL吐溫溶解于水，溶解于水定容至5L混合均勻，的濃縮液。按體積比，將1份濃縮液加入9份水混合均勻得呋喃C。

1.2 樣品的制備

從市場(chǎng)上購(gòu)買的樣品要先進(jìn)預(yù)處理，雞蛋樣品可直接放于4℃冰箱保存。畜禽、水產(chǎn)樣本洗凈后，首先將其攪碎，然后轉(zhuǎn)移至容器內(nèi)，然后加入一定體積的水在勻漿機(jī)中勻漿，將均質(zhì)后的樣品置于-20℃冰箱中保存。

1.3 提取過(guò)程

稱取樣品（4±0.1）g于50ml離心管中，加入呋喃A試劑（1-36鹽酸溶液）5ml，加入呋喃B試劑（二甲基亞砜）400微升，放在渦旋機(jī)上3000r/min，震蕩2分鐘。65℃水浴鍋孵育30min，加呋喃試劑C（三水合磷酸氫鉀）5ml，加呋喃試劑D（氫氧化鈉）1ml，放在渦旋機(jī)上3000r/min，震蕩1分鐘。加乙酸乙酯8ml，放在渦旋機(jī)上3000r/min，震蕩2分鐘。4000r/min離心5分鐘，取上層澄清溶液4ml于7ml離心管中，60℃氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.4 樣品的復(fù)溶

取已經(jīng)吹干的離心管，加入2ml正己烷，震蕩溶解殘?jiān)＜尤脒秽噭〦（PBST）1ml，1500r/min震蕩一分鐘，4000r/min離心2分鐘，棄上層溶液，取下層溶液待測(cè)。

2 膠體金檢測(cè)卡、試紙條的制備

呋喃妥因AHD膠體金免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，可以很好的運(yùn)用于動(dòng)物源性食品硝基呋喃妥因類代謝物的可視化檢測(cè)。呋喃妥因代謝物AHD膠體機(jī)試紙條最適條件為95-25的NC膜（硝酸纖維素膜），對(duì)樣品中呋喃妥因?qū)z測(cè)線為0.5微克/千克，金標(biāo)抗體中抗體使用量為166微克，金標(biāo)抗體標(biāo)記量為8，將抗體稀釋并緩慢加入金中，等待30分鐘。加入10%BSA封閉，等待30分鐘，放入冷凍高速離心機(jī)11000r/min，離心30分鐘。羊抗鼠二抗稀釋倍數(shù)0.3倍，抗原稀釋64倍，NC膜不需要封閉處理。

取出檢測(cè)卡，使用前將檢測(cè)卡和代檢樣品恢復(fù)至室溫（20℃到25℃）；（一次檢測(cè)樣品數(shù)量不要過(guò)多；如果檢測(cè)樣品過(guò)多，請(qǐng)分批檢測(cè)），用微量移液器移取100微升待測(cè)液于加樣孔中，使用計(jì)時(shí)器開(kāi)始計(jì)時(shí)，室溫（20℃到25℃）反應(yīng)5分鐘后判讀結(jié)果，其它時(shí)間判讀無(wú)效。

3 結(jié)果判讀

陰性（-）：T（檢測(cè)線）線比C（質(zhì)控線）線深或一樣深，表示樣品中待檢測(cè)物質(zhì)濃度低于檢測(cè)限，或不含待檢測(cè)物質(zhì)。

陽(yáng)性（+）：檢測(cè)T線比質(zhì)控C線淺，則表示樣品中待檢測(cè)物質(zhì)高于檢測(cè)限。

無(wú)效：質(zhì)控C線未顯色；表明操作過(guò)程不正確或檢測(cè)條已失效，請(qǐng)重新檢測(cè)一次。

使用前將試紙條、微孔試劑和待檢樣本恢復(fù)至室溫（20℃到25℃），將所需微孔試劑置于空微孔板架中；一次檢測(cè)樣品數(shù)量不要超過(guò)8個(gè)；如果一次檢測(cè)樣品數(shù)量超過(guò)8個(gè)，請(qǐng)按照8個(gè)一組，分批檢測(cè)。用移液器移去100微升待測(cè)液于微孔試劑中，緩慢抽吸至待測(cè)也與微孔試劑充分混勻，然后開(kāi)始計(jì)時(shí)室溫（20℃到25℃）孵育3分鐘。將標(biāo)記好的試紙條使印有Logo向上，另一端向下充分浸入微孔溶液中，然后開(kāi)始計(jì)時(shí)， 室溫（20℃到25℃）反應(yīng)5分鐘，取出試紙條去掉下端樣品墊并根據(jù)示意圖，在1分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，其它時(shí)間判讀無(wú)效。

陰性（-）：C（質(zhì)控線）、T（檢測(cè)線）線均顯色：表示樣品中不含有待檢物或其濃度低于檢測(cè)線。

陽(yáng)性（+）：質(zhì)控C線顯色，檢測(cè)T線不顯色，則表示樣品中待檢測(cè)物濃度高于檢測(cè)線。

無(wú)效：質(zhì)控C線未顯色；表明操作過(guò)程不正確或檢測(cè)卡已失效，請(qǐng)重新檢測(cè)一次。

4 注意事項(xiàng)

藍(lán)色和綠色記號(hào)筆、水筆可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成假陽(yáng)性影響，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免使用。

檢測(cè)試紙條請(qǐng)?jiān)诒Ｙ|(zhì)期內(nèi)一次性使用。

試劑使用完后請(qǐng)立即密封，并置于2℃到8℃避光干燥處立即保存，勿吸潮。

檢測(cè)試紙條應(yīng)避光干燥處保存，切勿冷凍。

檢測(cè)時(shí)避免陽(yáng)光直射和電風(fēng)扇直吹。

請(qǐng)勿使用自來(lái)水、純化水及蒸餾水作為陰性對(duì)照。

5 小結(jié)

本文用了膠體金免疫法，研究了不同的食品中硝基呋喃妥因類及其代謝物殘留。該法操作簡(jiǎn)便、快速、成本低，食品中呋喃妥因及其代謝物的殘留檢測(cè)提供了快速篩選方法。

【參考文獻(xiàn)】

[1]生成選.動(dòng)物源性食品硝基呋喃類藥物殘留調(diào)查分析與綜合預(yù)防控制技術(shù)研究.

[2]王習(xí)達(dá)，陳輝，陸文浩，等.水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留的檢測(cè)與控制.