我國豬流行性腹瀉疫苗研究與應用現狀

李 嬌 ，王文秀 ，謝金文 ，沈志強 ，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種急性、高度接觸性、病毒性腸道傳染病[1]，一直是嚴重威脅仔豬健康養殖的主要疫病之一。尤其自2010年末開始，我國豬場從南到北，從東到西陸續暴發了由PEDV變異毒株引起的以新生仔豬嚴重嘔吐、水樣腹瀉和高病死率為主要特征的腹瀉疫情[2]。目前PEDV變異毒株已是我國PEDV流行的優勢毒株，變異毒株在我國豬群中的流行已不容忽視，甚至普遍認為變異型PED將是未來幾年內危害仔豬最為嚴重的腹瀉病之一[2]。疫苗接種是預防控制PED的主要手段，自PEDV出現以來，針對PED疫苗的研究一直都在持續進行，過去受病毒培養困難等條件限制，PED疫苗研究與應用一直受阻，直到Hofmann等[3]研究發現在培養液中添加胰酶可提高PEDV在Vero細胞的適應性，使PED疫苗研究與生產得到迅速發展。目前我國商品化的PED疫苗主要有傳統PEDV滅活苗和弱毒苗，但滅活疫苗存在對豬的免疫保護力較弱、滅活不完全導致病毒擴散風險等缺陷，弱毒疫苗存在毒力增強、易產生變異株等缺陷。同時，隨著PEDV病原學和分子生物學研究的不斷深入，其免疫機理日益清楚，PEDV以典型的局部黏膜免疫為主，存在于血清中的IgG不能提供完全保護，只有腸道黏膜免疫所產生的分泌型抗體（SIgA）才能抵抗PEDV感染，哺乳仔豬通過初乳獲得母源SIgA，從而產生針對PEDV的被動免疫保護。就目前我國PED流行現狀而言，疫苗免疫仍是控制該病發生、流行和降低高病死率的最佳方法，疫苗應用依然是PED預防和控制的主要途徑。本文綜述了我國研究學者在PED滅活疫苗、弱毒疫苗等傳統疫苗以及亞單位、活載體疫苗等基因工程疫苗方面的研究與應用現狀，以期為新形勢下進一步開展PED疫苗的研發提供借鑒與參考，對制定和優化我國PED綜合防控措施具有一定的參考價值。

1 傳統疫苗

1.1 滅活疫苗

PEDV滅活疫苗是最常規的疫苗，制造工藝簡單，直接用人工繁殖獲得病原微生物，經滅活后作為抗原，具有安全、可靠的特點。目前，已經商品化的滅活疫苗為豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗。徐宏軍等[4]為研究PEDV常規疫苗毒株對現流行變異毒株的免疫保護效果，分別以轉瓶工藝與細胞懸浮培養工藝制備了PEDV轉瓶滅活苗與懸浮滅活苗，免疫攻毒保護試驗顯示懸浮滅活苗對仔豬保護率達80%，轉瓶滅活苗對仔豬保護率僅為20%，表明提高PEDV常規疫苗株的抗原含量，能夠有效提高常規滅活疫苗對PEDV流行變異毒株的保護效果。為篩選能用于變異型PEDV疫苗研發的流行毒株，代洪波等[5]進行PEDV變異毒株的分離鑒定及滅活疫苗免疫保護效果研究，結果顯示以PEDV-JX12分離株制備的滅活疫苗免疫母豬，對哺乳仔豬的保護率達93.75%，表明PEDV-JX12分離株能夠適應細胞培養，免疫接種母豬能給哺乳仔豬提供有效保護，可用于變異型PEDV流行毒株的疫苗研發。滅活疫苗性質比較穩定，易于保存和運輸，抗原含量達到一定水平后免疫母豬，可以有效防控哺乳仔豬PEDV的發生和流行。

1.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是一種將病原的致病力減弱但仍然具有活力的完整病原疫苗，將其接種動物后類似自然感染過程，在動物體內停留一段時期即可增殖產生大量抗原，可同時誘導較強的細胞免疫反應和體液免疫反應，產生良好的免疫保護效果，具有使用劑量小、免疫原性好、不需佐劑、成本低、使用方便等優點。通過篩選獲得PEDV弱毒疫苗株，即可制備出安全、效價高的弱毒疫苗，目前已經實現商品化的弱毒疫苗株有豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯活疫苗、豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病毒三聯活疫苗，PED使用的弱毒疫苗株主要有CV777株、P-5V株、KPED-9株和DR13株。但研究學者對我國2010年以來PEDV流行毒株的分子流行病學調查發現目前流行毒株與CV777等疫苗毒株相比，毒力基因發生了較大的改變[6-7]，由此推測以CV777株為代表的疫苗毒株對豬群的保護力不足，造成免疫失敗[8]。故毒株的選擇及其免疫原性、毒價是弱毒疫苗研發和生產應用的關鍵技術指標，在PEDV流行毒株不斷發生變異的情況下，篩選并致弱免疫原性、毒價高的變異毒株是研發新型PEDV弱毒疫苗的緊要任務和必由之路。

2 基因工程疫苗

隨著現代生物學技術日新月異的發展，基因工程疫苗逐漸成為PED疫苗研究的熱點。目前利用基因工程技術已經和正在研制開發的PED新型疫苗主要有腺病毒重組疫苗、枯草芽孢桿菌重組疫苗、轉基因玉米疫苗、大腸桿菌表達的亞單位疫苗、桿狀病毒表達的亞單位疫苗、畢赤酵母表達的亞單位疫苗，但均位于試驗研究階段，均未實現商品化生產。

2.1 腺病毒重組疫苗

腺病毒載體已被廣泛用于疫苗開發，是一種安全有效的活病毒載體。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）屬于造血生長因子，能夠刺激免疫細胞產生細胞因子，增強抗原遞呈細胞功能，在機體免疫調節中起重要作用，能增強疫苗的免疫效果，具有免疫佐劑的功能。趙攀登等[9]利用腺病毒表達系統構建了串聯表達GM-CSF和PEDV S1蛋白的重組腺病毒，經間接免疫熒光和Western-blot檢測顯示，S1和GM-CSF蛋白在重組腺病毒中獲得表達，該重組腺病毒的獲得為PEDV腺病毒重組活載體疫苗的研究奠定了基礎。

2.2 枯草芽孢桿菌重組疫苗

枯草芽孢桿菌在缺乏營養或其他迫脅條件下，芽孢衣殼蛋白基因能表達一種抗逆性的休眠體—芽孢，以外層芽孢衣殼蛋白為分子載體，通過芽孢表面展示技術將外源目的蛋白展示于芽孢表面，既能制備出具有特定生物活性的重組芽孢。重組芽孢不僅具有外源蛋白特有的生物活性，而且還攜帶芽孢本身獨特的抗逆性，能夠長期存活并順利通過胃腸屏障激發腸道黏膜免疫。戴茜茜等[10]將PEDV S蛋白保護性抗原片段COE1與枯草芽孢桿菌芽孢外層衣殼蛋白基因cotB進行重組，構建融合表達cotBCOE1的整合型重組質粒，重組質粒與枯草芽孢桿菌淀粉酶基因amyE雙交叉，獲得重組枯草芽孢桿菌，對重組枯草芽孢桿菌進行淀粉酶活性分析、PCR鑒定、Western-blot分析、免疫熒光試驗，表明PEDV S蛋白保護性抗原片段COE1成功地展示于枯草芽孢桿菌芽孢表面，且保護性抗原片段具有良好的免疫原性，為研制PEDV新型、口服枯草芽孢桿菌重組疫苗奠定了基礎。

2.3 轉基因玉米疫苗

利用轉基因植物生產動物基因工程疫苗用于疾病的預防及治療已成為植物基因工程的一個新興研究領域。滿坤等[11]根據玉米密碼子的偏好性，設計合成優化的PEDV主要中和抗原表位COE編碼基因，構建了植物表達載體pBAC9036，將其轉化玉米自交系501的幼胚，通過分化再生培養和田間草甘膦抗性篩選獲得了2個轉基因玉米穩定株系，經PCR、間接ELISA和Western-blot等鑒定表明COE基因已成功整合到玉米基因組并進行了轉錄和蛋白表達，分別提取轉基因玉米穩定株系葉片和種子的可溶性蛋白提取物，分別與佐劑混合后皮下注射小鼠，免疫小鼠均可產生針對PEDV COE基因的特異性抗體。表明成功獲得的轉基因玉米可有效表達COE蛋白，且表達產物具有顯著的免疫原性，為進一步開發PEDV轉基因玉米疫苗奠定了基礎。

2.4 大腸桿菌表達的亞單位疫苗

原核表達系統無法對表達的外源蛋白進行翻譯以及翻譯后的加工和修飾，但原核表達系統以其培養方便、操作簡單、成本低廉、表達量高、易于純化等優點，仍然成為外源蛋白表達的首選表達系統。桂銳等[12]將PEDVS1基因主要抗原區域克隆至pET-30a原核表達載體，構建原核表達質粒，轉化至大腸桿菌BL21中，經IPTG誘導獲得了以包涵體形式表達的重組蛋白，Western-blot分析顯示重組蛋白能夠被PEDV多抗血清特異性識別，具有良好的反應原性，為進一步研制亞單位疫苗奠定了物質基礎。

2.5 桿狀病毒表達的亞單位疫苗

桿狀病毒表達載體系統是一個以桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細胞為受體的表達系統，其表達后的產物可進行包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除及肽段的切割和分解等在內的翻譯后加工和修飾，保證了所表達的重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白。譚博敏等[13]將PEDV主要抗原表位S1和M基因克隆到桿狀病毒雙表達載體pFastBacTMDuai中，構建了重組轉移質粒pFBD-S1-M，并將其轉化至DH10BacTM感受態細胞中制備重組穿梭質粒Bacmid-S1-M，轉染Sf9昆蟲細胞后，拯救出能夠共表達S1和M蛋白的重組桿狀病毒rBacmid-S1-M，經SDS-PAGE和Western-blot檢測表明，表達產物能與PEDV多克隆抗體發生特異性反應，表明共表達的蛋白具有良好的反應原性，為PEDV基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎。2.6 畢赤酵母表達的亞單位疫苗

巴斯德畢赤酵母表達系統兼有原核表達系統和真核表達系統的優點，操作方便、生長快速、表達量高，又能對外源蛋白進行翻譯以及翻譯后加工和修飾。胡青松等[14]將PEDV S蛋白部分保護性抗原COE基因導入畢赤酵母表達載體，構建畢赤酵母pPIC9K-COE重組質粒，并電轉化入酵母感受態細胞GS115中，篩選高拷貝陽性重組菌進行誘導表達，SDS-PAGE和 Western-blot分析表明 PEDV COE基因可在畢赤酵母中獲得分泌表達，且表達的重組蛋白具有很好的生物學活性，病毒中和試驗表明重組蛋白免疫后的小鼠血清中能夠檢測到PEDV特異性中和抗體，為利用巴斯德畢赤酵母表達系統開發PEDV亞單位疫苗奠定了基礎。

3 小結與展望

PED發病急、病程短，豬只年齡越小死亡率越高，近幾年來變異型PED成為影響我國仔豬健康的最重要病毒性腸道傳染病，研發和應用安全、有效的PED疫苗對控制和清除PEDV至關重要。對于PEDV的疫苗，滅活疫苗只能誘導體液免疫，仔豬只能通過哺乳獲得SIgA，保護效果不佳，弱毒疫苗存在散毒和返祖的危險，同時現有滅活疫苗和弱毒疫苗抗原含量均偏低，且疫苗株對PEDV變異毒株的保護效果不確切。故篩選以臨床分離培養的變異毒株作為疫苗候選毒株，優化和改進現有的商品化疫苗，馴化出免疫原性好且毒價高的弱毒株將是PEDV常規疫苗研發和產業化的重點。PEDV基因工程疫苗尚處于研究階段，但新型基因工程疫苗通過口服可以在腸道快速定植，產生SIgA抗體，達到理想的黏膜免疫效果，其將在PED防控中起到越來越重要的作用，將具有廣闊的開發和應用前景。相信隨著分子生物學、免疫學、基因工程技術的不斷發展，以及PEDV致病機理和免疫機制研究的不斷深入，PEDV疫苗研究均將逐步得到完善，不斷為我國PED的綜合防控提供技術保障。

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