miRNAs與肺動脈高壓的研究進展

王健 謝新明 李滿祥

肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension, PAH)是一種由多因素引起的肺血管功能及結構異常，導致肺血管阻力增加，引起肺動脈壓異常升高的臨床綜合征，嚴重時引起右心衰甚至死亡[1-3]。盡管目前臨床上肺動脈高壓診斷及治療策略越來越多，但其預后仍舊較差。有流行病學資料顯示特發性及遺傳性PAH患者在經過常規治療后，5年生存率僅為20.8%[4]。國內外研究提示微小RNA(microRNA/miRNA)可與其靶 mRNA 3'端非編碼區(3′-Untranslated Regions, 3′-UTR)特異性結合，引起靶mRNA翻譯抑制或降解，在細胞的生長、分化等過程中發揮重要作用。研究發現 miRNA在PAH的發生、發展中起重要作用，因此識別PAH發病相關的miRNA及其作用靶點有望為PAH診治提供新的途徑。本文就miRNAs在PAH的發病機制及診治方面的研究進展作一綜述，并探討其在PAH診斷、治療方面的應用前景。

一、miRNAs概述

miRNAs是一類內生的長度約22個核苷酸的非編碼RNA，參與調控細胞分化、增殖、凋亡等多種生物學功能[5]。細胞核內轉錄生成的初級miRNA(Pri-miRNA)經Drosha酶復合體剪切成為前體miRNA(Pre-miRNA)后被輸出蛋白5(Exportin-5)轉運出核而進入胞質，接著Pre-miRNA再被Dicer酶復合體水解成為約22個核苷酸長度的雙鏈RNA并與Ago2蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)[6]。RISC與靶mRNA的3′-UTR特異性結合后主要通過兩種方式發揮作用，當RISC與靶mRNA的3′-UTR完全互補配對時，RISC就會將靶mRNA降解；當兩者不充分配對時，miRNA-5p則會持續抑制mRNA的翻譯或使mRNA的翻譯過程提前終止，最終導致基因的沉默[7]。

miRNAs在生理狀態下參與調節細胞增殖、組織分化過程。例如，miR-375可通過PI3K/AKT信號通路使鈣粘素發生顯型轉換并促進胰島β細胞基因表達，調節胰島細胞的增殖、分化[8]。miRNAs亦參與腫瘤、心血管疾病、皮膚病等眾多疾病的病理過程[9-14]。例如，miR-424/503通過上調Rictor蛋白的表達激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路促進腫瘤組織的增殖和遷移[15]。此外，miRNAs在PAH的發病過程中也起著重要作用[16-17]。

二、PAH的發病機制

PAH的發生與基因、環境、代謝等多種因素相關，不同類型的PAH有著各自的特征，但其發病機制相似，包括：肺血管收縮、肺血管重塑及原位血栓形成[18-20]。

在PAH早期，內、外源性刺激(如缺氧、炎癥等)引起肺血管收縮，肺動脈壓力升高，當刺激消失后，肺血管重新舒張，肺動脈壓力恢復；隨著PAH進展，肺動脈收縮呈現持續性、不可逆性，引起肺動脈壓力持續升高。

肺血管重塑是PAH發生的主要機制，包括肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)和肺動脈內皮細胞(pulmonary artery endothelial cells, PAECs)的異常增殖，成纖維細胞的增殖及分泌功能活躍，細胞外間質的異常增多等，這些病理改變引起的血管重塑最終導致血管壁增厚僵硬、管腔狹窄，導致肺血管壓力不可逆性升高，最終引起PAH的發生[19, 21-22]。

原位血栓形成也會引起PAH的進展。PAH常常伴隨著炎癥、感染等病理過程，而這些病理過程又常常導致血液呈高凝狀態，使肺血管局部形成大量微血栓，加重肺血管阻力，最終導致肺動脈壓力持續升高。

三、miRNAs與PAH的發病關系

1. miRNAs與肺血管收縮: 各種類型的PAH均存在肺血管緊張性升高，這與血管局部舒縮血管的生物活性物質比例失衡相關。研究報道，缺氧可誘導PASMCs和PAECs中的miR-21表達上調，通過作用于BMP信號通路，引起內皮素1(endothelin 1，ET-1)表達升高，促進肺血管收縮[18]。此外，在缺氧時，肺血管中miR-190表達增高而miR-328下降，前者可使電壓門控K+通道KCNQ5(Kv7.5)的活性下降，后者則使L型鈣離子通道α1C(Cav1.2)數量下降，兩者均導致Ca2+內流相對增加，促進肺血管收縮[23-24]。關于miRNAs與肺血管收縮的研究仍較少，miRNAs在肺血管收縮中的作用機制仍需更多研究。

2. miRNAs與肺血管重塑: 肺血管重塑是PAH發生的主要機制之一，研究發現miRNAs參與肺血管重塑過程。例如，miR-21、miR-27a、miR-17-92家族、miRNA-124、miRNA-143/145、miRNA-204、miRNA-424/503等。

研究證實miR-21在人腦膠質母細胞瘤、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中表達明顯增加，這使miR-21在各種疾病的發生中被廣泛關注[11]。研究證實在缺氧的PASMCs和PAECs中miR-21表達明顯增加[25]，其通過作用于編碼程序性細胞死亡因子4、Sprouty2蛋白的基因，使這些抑癌基因在轉錄后水平被抑制或沉默，進而使PASMCs和PAECs過度增殖，導致肺動脈內膜及中膜的肥厚，促進PAH的發生[11, 26]。

miR-27a在腫瘤細胞中異常表達，研究認為其作為潛在的癌基因參與腫瘤的發生[14]。miR-27a可通過Smad通路、Wnt/β-catenin通路以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通路等多種途徑調控細胞的凋亡及增殖活性[14, 27-28]。研究發現，miR-27a在PAH模型小鼠PASMCs和PAECs中的表達顯著增加，其通過下調內源性保護因子PPARγ的表達使其抗增殖作用減弱，引起PASMCs及PAECs的異常增殖[16-17, 29]。Kang 等[29]的研究指出PPARγ的表達可以被miR-27a下調，但激活PPARγ受體后miR-27a的表達減少，形成了一個互相作用的環路。如何調控兩者之間的作用仍需進一步的研究，這可能會為PAH的治療提供新的思路。

miR-17-92家族包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-92a-1。研究認為，miR-17-92家族可能作為癌基因與乳腺癌、眼癌、白血病等多種腫瘤細胞的異常增殖有關[13]。研究發現，IL-6可通過信號轉導子與轉錄激活子3通路促進miR-17-92家族的轉錄，而miR-17-92家族可以下調骨形成蛋白受體2的表達，減弱骨形成蛋白的抗增殖及促凋亡效應，最終引起PASMCs和PAECs的異常增殖，促進PAH的發生[30]。

miR-124主要表達于腦組織中并對正常神經發育有重要影響[12]。研究證實腦外表達的miR-124可以通過鞘氨醇激酶1通路或者通過下調Rho相關的卷曲蛋白激酶1的表達抑制癌細胞增殖、遷移及侵襲[12]。研究發現，miR-124可以通過結合鈣調蛋白結合轉錄激活因子1基因和多聚嘧啶序列結合蛋白1基因等靶基因，從而抑制活化T細胞核因子(activated t nuclear factor, NFAT)的去磷酸化及NFAT向細胞核的轉移，進一步抑制PASMCs的增殖[31-32]。但miR-124在缺氧刺激的人PASMCs中表達明顯減少，這為PAH提供了潛在的治療靶點。

miR-143/145是調節平滑肌細胞(smooth muscle cells, SMCs)在靜止態和增殖態之間轉換的兩個關鍵miRNAs，且在迅速增殖的腫瘤細胞中兩者均表達減少[33]。激活TGF-β信號通路和骨形成蛋白4信號通路可促進miR-143/145轉錄，其作用于Kruppel樣因子4/5基因，使平滑肌特異性基因如平滑肌肌動蛋白基因、調寧蛋白基因及平滑肌22α基因表達增強，促進血管SMCs的分化，抑制血管SMCs增殖[34]。但是，Caruso等[35]的研究發現，BMPR2突變的PAH患者PASMCs中miR-145的表達高于正常，機體是否存在某種反饋作用機制目前尚不完全清楚，仍需進一步研究來明確。

研究發現，miR-204在PAH動物模型及PAH患者的肺組織中表達減少，且其下降幅度與PAH進展的程度呈正相關；此外，在使用miR-204類似物干預PAH小鼠后發現其肺動脈壓明顯下降，且其肺小動脈內膜厚度較前變薄[36]。研究認為，miR-204可通過信號轉導子與轉錄激活子3信號通路及NFAT信號通路形成一個正反饋環路，激活酪氨酸磷酸酶2和酪氨酸激酶，使NFAT表達持續增加，導致PASMCs和PAECs的增殖并使其凋亡減少，促進PAH進展[36]。

編碼miR-424和miR-503的基因位于X染色體上，兩者往往共同轉錄而發揮生物學作用[37]。miR-424/503可通過上調Rictor蛋白的表達激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路促進腫瘤組織的增殖和遷移[15]。研究發現，miR-424/503通過抑制轉錄后過程而減少成纖維細胞生長因子2及成纖維細胞生長因子受體1的合成最終抑制細胞增殖。PAH患者PAECs中miR-424/503表達明顯減少，導致PAECs異常增殖[37]，參與肺血管重塑過程。

3. miRNAs與肺血管原位血栓形成: PAH常伴發肺血管局部廣泛微血栓形成，這與PAH伴發的炎癥及血液的高凝狀態有關。研究發現，miR-759可以直接與纖維蛋白原α基因的mRNA結合使其翻譯產物減少，導致機體對炎癥、感染的耐受性下降，從而引起蛋白的錯誤折疊并增加組織損傷，最終增加原位血栓形成的風險，加速PAH的發生發展[38]。目前關于miRNAs與PAH原位血栓形成風險相關的機制研究仍較少，期待這一領域能有更多發現。

四、miRNAs在PAH中的診斷價值

PAH患者早期臨床表現缺乏特異性，大部分患者在出現胸痛或暈厥時才首次診斷，這導致PAH的首次診斷時間延遲約2.8年，出現不可逆的肺血管重塑，因此探討新的早期診斷方法很有必要[39]。PAH相關研究發現，PASMCs和PAECs中多種miRNAs表達異常。同時，實驗室研究已經能夠通過RT-qPCR技術對miRNAs進行穩定重復測定，展現出miRNAs在PAH診斷方面的潛力[40]。研究顯示，miR-150、miR-204、miR-130/301家族能夠對PAH的嚴重性和預后做出預測[36, 41-42]；此外，研究發現miR-21、miR-23b、miR-130a、miR-133b、miR-204、miR-208b、miR-491、miR-1246等眾多miRNAs在PAH進展時血清水平明顯升高，其診斷意義仍需進一步研究[43]。但是，miRNAs的應用仍存在諸多挑戰。一些miRNAs同時在腫瘤組織中表達異常[11, 14]，如何將其與PAH做出合理的鑒別仍較困難。此外，目前關于miRNAs診斷應用的研究多局限在實驗室，尚缺乏大規模臨床試驗，而各研究由于其組織來源、實驗技術方法的不同，其miRNAs的檢測結果缺乏可比性，因此缺乏對診斷PAH的統一標準。期待通過更深入的研究能夠發現特異的、敏感的miRNAs并將其應用于對PAH的早期診斷。

五、miRNAs與PAH的治療

miRNAs參與PAH的發生、發展，因此，調節miRNAs在體內的表達水平成為PAH潛在治療策略之一。研究顯示，過表達miR-21后，PASMCs和PAECs增殖明顯加速[25]；而在過表達miR-124后，PASMCs的增殖明顯被抑制[31]，這顯示出miRNAs在PAH治療方面的應用前景。目前該方面的研究主要為應用miRNAs類似物[36]及miRNAs拮抗物[44]進行干預以促進細胞正常功能的發揮并抑制其異常增殖。例如，Courboulin等[36]應用miR-204類似物干預PAH模型小鼠后其疾病進展明顯延緩；Liu等[45]證實敲除miR-221/222的動物模型中血管平滑肌細胞的增殖及新生血管的形成明顯受到抑制；Brock等[46]將miR-20a拮抗物應用于缺氧PAH模型后發現肺動脈中BMPR2水平恢復正常且血管重塑被抑制。盡管如此，miRNAs在PAH治療方面還存在諸多難題。例如，如何使miRNAs靶向進入肺組織以實現對PAH的精準治療同時避免其出現脫靶效應而進入其他組織產生副作用，如何掌控miRNAs的最佳劑量以實現個體化用藥使其不良反應降至最低，等等。這些問題在今后的研究中或許需要更多關注。目前雖未見miRNAs在PAH方面的臨床試驗資料發表，但值得注意，已經有miRNAs進入針對慢性丙型肝炎等其他疾病的臨床試驗并取得了一定突破[47-48]，這可能對miRNAs在PAH治療方面的應用提供一些參考，希望能早日將miRNAs應用于PAH的治療當中。

綜上所述，miRNAs作為一類對基因表達調控有重要作用的RNA，在PAH的發病、診斷及治療中可能扮演著重要角色。miRNAs的種類眾多，其在PAH領域的研究仍需繼續推進，相信通過檢測及靶向干預miRNA終會為PAH患者帶來福音。

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