嗜肺軍團菌致病機制及快速檢測最新研究進展

魯曦 李王平 李春夢 孫瑞琳 房延鳳 金發光

軍團菌(Legionella)在1976年被首次報道，當時在美國費城參加退伍軍人聚會的老兵中有182人出現了嚴重的肺炎癥狀，147人住院，29人死亡[1]。經過密切的調查之后，發現致病菌是一種革蘭氏陰性桿菌，命名為嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)[2]。自軍團菌首次報道之后很短的時間內，共發現了50余種軍團菌，其中至少24種與人類疾病相關。90%以上的軍團病是由嗜肺軍團菌導致[3]，但在某些特定條件下，免疫缺陷患者可能對任何軍團菌種普遍易感。嗜肺軍團菌共有15種血清型，在全世界范圍內有84%的軍團菌感染是由血清1型引起。一項在法國的環境與臨床對比研究中發現，嗜肺軍團菌血清1型占環境中軍團菌的28%，但卻占患者體內分離到軍團菌的95%[4]。其余人類易感軍團菌包括：波茲曼軍團菌(Legionellamicdadei)、米克達德軍團菌(Legionellamicdadei)和長灘軍團菌(Legionellalongbeachae)共占人類軍團菌感染的2%～7%[4]。

軍團病于1982年在我國南京首次報道[5]以來，在我國成散發和小規模局部暴發，受到了我國政府和衛生部門的高度重視。因此，了解軍團菌感染機制、熟悉軍團菌最新的檢測技術是控制軍團病的關鍵所在。本文對該領域最新研究成果進行簡要綜述。

一、 嗜肺軍團菌的致病機制

1. 嗜肺軍團菌在真核細胞內復制的機制研究進展： 嗜肺軍團菌與真核細胞的相互作用，是理解該菌致病機制的關鍵。一般而言，吞噬體利用細胞內吞作用形成可以被消化的囊泡，隨后與溶酶體融合后通過酸化和蛋白酶的作用將大多數微生物降解消化[6]。然而，含有軍團菌的囊泡(Legionellacontaining vesicles, LCV)卻能夠推遲與溶酶體的融合[7]。首先，通過PI-3激酶依賴(或非依賴)的方式發生軍團菌內吞，形成LCV[8]，初級LCV能夠推遲溶酶體融合與酸化，在內吞作用發生的5 min內，LCV開始募集內質網分泌的囊泡，這些囊泡原先是用于內質網和高爾基體之間物質交換的，在內吞作用之后的4～10 h，LCV就利用了這些囊泡中的蛋白質在pH中性的LCV中，以二分裂的方式開始復制，并突破宿主細胞[9]。在LCV形成之后的18～24 h之后才開始出現內吞作用的標志物(包括LAMP-1、組織蛋白酶D和Rab5)，而這些標志物在內吞大多數微生物之后的早期就會出現[10]。

最近研究發現，LCV能夠特異的招募Rab1分子，而非Rab2和Rab6。實驗發現抑制Rab1活性，能夠抑制嗜肺軍團菌在胞內的復制[11]；利用RNA干擾技術發現Sar1和Arf1分子敲減，也能夠抑制嗜肺軍團菌在胞內的復制[12]。此外某些證據表明，嗜肺軍團菌對宿主細胞自噬的調控作用對其在胞內復制也十分重要，例如，與自噬有關的Atg7和Agt8表現出能夠與LCV短暫的交聯，這種相互作用可能是利用自噬為嗜肺軍團菌的胞內復制提供營養[13]。但也存在一些相反的證據，例如自噬缺陷的宿主細胞并不影響嗜肺軍團菌的復制[14]。因此，自噬對嗜肺軍團菌復制的影響仍需進一步研究。

2. 嗜肺軍團菌進出真核細胞的分子機制研究進展： 人們對于嗜肺軍團菌如何進入真核細胞并最終釋放和感染其他細胞的過程知之甚少。目前在該領域存在兩種假說，其一為利用宿主傳統的內吞作用進入細胞的假說：例如研究人員發現了某些哺乳動物細胞和阿米巴蟲，能夠通過卷吞噬作用(coiling phagocytosis)使嗜肺軍團菌進入宿主，但這種機制(卷吞噬作用)發生頻率很低[15]；再比如骨髓來源的巨噬細胞通過大胞飲(macropinocytosis)作用使軍團菌進入宿主[16]；此外還有經典的拉鏈樣機制和調理素依賴的吞噬機制[17]，都屬于支持嗜肺軍團菌利用宿主內吞作用進入細胞的證據。此外，即使像PI-3激酶介導內吞這種有較多證據、且相對成熟的機制也同樣存在爭議：例如最近的一項研究，利用PI-3激酶抑制劑(wortmannin)并沒有顯著影響巨噬細胞對嗜肺軍團菌的內吞作用[18]。

第二種假說是毒力因子介導的侵襲作用：其證據包括非吞噬細胞中的實驗，例如A549， CHO-K1和HeLa細胞實驗均支持這一假說[19-21]。目前已發現有5種蛋白與嗜肺軍團菌侵襲相關，他們分別是EnhC、LpnE、RtxA、LvhB2和HtpB，其中研究得相對透徹的是HtpB蛋白，當嗜肺軍團菌進入宿主細胞形成LCV之后，HtpB蛋白在宿主細胞和LCV中表達上調[22]。最新研究結果表明HtpB對于募集線粒體至初始LCV的過程中起到了關鍵作用[23]。

3. 嗜肺軍團菌基因組： 截至作者發稿(2017年12月)，已有67株嗜肺軍團菌基因組被完整測序， GC%介于38.1%～38.6%，基因組大小介于2.68M～3.78M、預測基因數量介于2 945～3 512個。根據生物信息學比對分析，發現不同嗜肺軍團菌基因組中有80%左右的基因同源，只有10%左右的基因為菌株特異性。研究發現，這些菌株特異性基因組區域的GC含量與全基因組平均GC含量存在較大差異，例如費城1型株特異性基因組到包含一個trb/tra區域和若干外排泵基因[24]。推測這些區域可能是通過種間的基因水平傳播獲得[25]。而對于嗜肺軍團菌的核心區域編碼，基本與感染宿主、復制等過程相關，這些核心區域高度保守[26]。系統進化樹分析發現，嗜肺軍團菌共有四大譜系，但各種譜系與菌株分離的地理位置以及流行性并不相關[26-27]。以上實驗說明嗜肺軍團菌具有高度多樣性，目前難以從基因組水平判斷某種嗜肺軍團菌的感染能力。

4. 嗜肺軍團菌毒力因子研究進展： 嗜肺軍團菌不僅具有多種傳統的細菌毒力因子，例如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、鞭毛(flagellum)、Ⅱ型分泌系統和外膜蛋白等，還能夠利用Dot/Icm Ⅳ型分泌系統向真核宿主細胞內傳遞將近300種效應蛋白，并影響宿主生理活動。下面對這種嗜肺軍團菌特有且具有十分重要的分泌系統的研究進展進行簡要概述。

目前研究發現，Dot/Icm Ⅳ型分泌系統組分幾乎參與了胞內生存嗜肺軍團菌的各種生理活動，例如嗜肺軍團菌進出宿主細胞、胞內復制、LCV形成、甚至能夠抑制宿主細胞凋亡。該系統分為兩個致病域，其中Ⅰ區由dotDCB和dotA-icmVWX基因編碼[28]，Ⅱ區由18個不同型的dot和icm基因編碼[29]。Dot/Icm Ⅳ型分泌系統組成的跨膜蛋白在嗜肺軍團菌表面形成一種類似菌毛的結構，能夠插入宿主細胞質膜和LCV膜進而傳送多種效應蛋白。例如LidA，作為該分泌系統最早鑒定的效應分子，與Rab的捕獲識別相關，能夠識別包括Rab1、Rab6和Rab8在內的多種Rabs[30-31]。SidM分子能夠專一性識別Rab1分子，具有3個結構域，其中N端結構域負責修飾Rab1，C端參與該分子與LCV膜的錨定作用[32-33]?？傊?，Dot/Icm Ⅳ型分泌系統在利用宿主細胞調控囊泡轉運、形成LCV，進而逃避降解、抑制宿主細胞凋亡并參與復制中均起到了關鍵性作用。

5. 嗜肺軍團菌感染的免疫應答

(1) 嗜肺軍團菌感染的固有免疫應答： 軍團菌感染的各種動物模型中發現豚鼠對嗜肺軍團菌易感，氣溶膠暴露3 d即可出現軍團菌感染的癥狀[34]，但是絕大多數小鼠卻對除長灘軍團菌(L.longbeachae)之外的軍團菌產生天然抵抗，而這為研究對軍團菌的免疫應答提供了有利條件。研究發現對軍團菌高度抵抗的C57BL6小鼠13號染色體中lgn1位點存在一系列高度多態性的重復序列，其中包括神經元細胞凋亡蛋白(Naip)，和棒狀病毒IPA(Birc1)都與嗜肺軍團菌易感性相關[35-37]。Naip5是一種細胞內鞭毛蛋白識別分子,一旦巨噬細胞吞嗜肺軍團菌，Naip5會立刻激活caspase-1，進而導致IL-1β產生，并促進LCV與溶酶體融合，最終將嗜肺軍團菌降解[37]。同時發現Naip5的敲除能夠逆轉對嗜肺軍團菌在細胞內復制的限制作用[38-39]。一項最新的研究發現，MyD88，一種Toll樣受體的配體分子的敲除，能夠增加小鼠肺內嗜肺軍團菌載量，降低嗜肺軍團菌感染小鼠的生存率[40]。

雖然小鼠感染模型研究已比較透徹，但是對人感染嗜肺軍團菌的固有免疫應答仍知之甚少。在一項回顧性分析研究中發現，嗜肺軍團菌感染患者的IFN-γ水平比非軍團菌感染患者低[41]，提示IFN-γ產生能力降低，與嗜肺軍團菌的易感性相關。軍團菌感染后宿主細胞以釋放Th1型細胞因子以限制軍團菌的復制[42]。此外對于軍團菌易感人群的研究中發現，TLR多態性是軍團菌感染的獨立風險因素，TLR5在392位為終止密碼子的TLR5392STOP型在人群中的比例大約為10%，但軍團菌易感性卻顯著高于其他類型TLR5的人群[43]。

(2)嗜肺軍團菌感染的適應性免疫： 盡管多種炎癥反應對于機體控制軍團病的進展十分重要，但是T細胞和B細胞對于清除感染依然不可或缺。例如：在小鼠體內的研究發現，利用CD5或CD8 T細胞的單克隆抗體處理小鼠，能夠降低嗜肺軍團菌感染小鼠的生存率，并且會極大的加速感染模型中軍團菌的清除時間[44]，然而，對于上述免疫細胞如何被激活并產生保護作用的具體機制仍然知之甚少。小鼠骨髓來源的樹突細胞或巨噬細胞被嗜肺軍團菌感染后能夠刺激CD4 T細胞產生IFN-γ，同時發現 CD4 T細胞的激活有賴于LCV的形成并且抑制與溶酶體的融合作用[45]。以上結果提示，雖然宿主內的嗜肺軍團菌存在于LCV中，但依然能夠為CD4 T細胞提成抗原。例如，感染嗜肺軍團菌的小鼠，DC細胞能夠上調CX3CL1趨化因子，進而誘導T細胞激活[46]。

在人類嗜肺軍團菌感染的研究中已證實存在細胞介導的免疫反應，但成果有限。根據臨床觀察發現，接受激素治療和艾滋病，以及某些類型的血液疾病是罹患軍團菌病的風險因素[47]。

二、 嗜肺軍團菌檢測技術進展

1. 傳統微生物培養法： 軍團菌的分離培養是軍團病確診以及流行病學研究的金標準，該方法是利用了嗜肺軍團菌在GVPC和BCYE瓊脂平板上生長，但在L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板上不生長這一特點，再經進一步生化試驗和血清學實驗進行確認的技術。菌落一般呈灰白色，偶見紫色或藍綠色。雖然該方法檢測周期長，不利于現場快速診斷，但該技術結果可靠，而且對于獲得軍團菌完整信息，例如研究其基因背景、耐藥性或分子分型依然十分必要。

2. 免疫學檢測技術： 抗體檢測：患者體內特異性IgM能夠作為軍團菌感染的早期診斷依據，常用的檢測方法包括間接凝血實驗(indirect hemagglutination, IHA)、酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、微量凝集實驗(micro agglutination experiment, MAT)等，其中IHA可以診斷嗜肺軍團菌1-4型血清型的抗體；ELISA用于檢測軍團病疑似患者體內特異性IgG水平，常用于流行病學回顧性分析[48]。雖然免疫學檢測受限于患者免疫狀態，并且存在與其他病原體交叉的情況，尤其是難以對急性感染和既往感染進行鑒別，不過，抗體檢測技術操作簡便，目前仍在使用。

抗原檢測：通過對疑似患者呼吸道分泌物進行直接免疫熒光檢測，能夠快速特異的檢測，但該技術靈敏度低，與某些致病菌(例如銅綠假單胞菌)存在交叉反應。此外，尿抗原是臨床上常用的軍團菌檢測方法，該方法檢測靶點為軍團菌細胞壁的熱穩定性LPS。由于軍團菌尿抗原會在感染后1 d即可檢出并持續若干天，目前已有多種尿抗原檢測產品評價的論文發表[49]。該技術操作簡單，樣本易獲取，可用于早期診斷，但該技術目前只能對嗜肺軍團菌1型血清型進行檢測，且成本較高。

3. 基于脂肪酸檢測技術進展： 脂肪酸分型技術是根據微生物短鏈脂肪酸(C9-C10)種類和含量的特異性與多樣性，利用氣相色譜儀對微生物短鏈脂肪酸進行鑒定，并與數據庫進行比對，從而快速準確的對微生物進行鑒定和分型的新技術[50]。目前該技術獲得美國CDC和FDA認證，具有較高的應用價值。但該方法只能對分離得到的菌株進行檢測，而無法對環境或臨床樣本直接檢測。

4. 核酸水平檢測技術進展

(1)基于PCR的檢測技術： PCR是一種可靠的核酸擴增技術，對于嗜肺軍團菌，常利用mip基因和16S rRNA作為靶基因進行檢測，mip基因具有嗜肺軍團菌種特異性；而16S rRNA基因不僅可以用于嗜肺軍團菌的特異性檢測，而且能夠對軍團屬進行鑒別[51]。目前常用熒光定量PCR對臨床及環境樣本直接檢測，具有快速靈敏的特點，而且是目前除分離培養技術之外唯一被寫入標準技術規范的檢測方法。

(2) 基于等溫擴增的檢測技術： 等溫擴增技術也屬于核酸擴增技術，種類較多、發展迅速。由于擴增溫度恒定而不需要依賴PCR儀，具有簡便、快速、靈敏的特點更加適用于現場快速檢測，目前主流技術包括NASBA、HAD、RCA和LAMP技術。由于LAMP技術成本較低，目前國內外多家體外診斷試劑公司已成功開發除軍團菌檢測試劑盒并上市。雖然等溫擴增技術原理復雜，但是操作簡單，有利于推廣應用[52]。

(3)基于探針雜交的檢測技術進展： 利用探針雜交技術應用于軍團菌的檢測，具有一定前景，由于可將探針連接在芯片上從而實現高通量檢測，同時不僅能夠對軍團菌的屬、種進行鑒定和鑒別，同時還能夠了解軍團菌的毒力基因和耐藥基因等遺傳背景信息。該技術的高通量特點極大節省了人力，但由于操作復雜，依賴復雜的儀器設備和人員數據處理能力，目前尚未普及。

(4)基于二代測序的檢測技術進展: 二代測序是相對于焦磷酸法測序(一代)而言的高通量測序技術，目前市場上主流使用的是Illumina公司生產的各型號測序平臺以，而羅氏公司的454測序儀已經退出市場。二代測序平均讀長約為幾百bp，可以通過提高測序深度達到提高分辨率和靈敏度的目的。二代測序的問世極大降低了每個堿基測序成本，為深入進行軍團菌的基因組、轉錄水平研究提供了有力工具[53]。此外基于16S的測序也為嗜肺軍團菌所處環境的菌群研究提供了技術保證。

雖然嗜肺軍團菌屬于環境微生物，但它能夠在真核細胞內復制，并且逃避宿主免疫系統攻擊而導致嚴重的肺炎。隨著高通量測序技術的推廣，越來越多軍團菌菌種以及它們的毒力因子和效應蛋白被發現，極大地加深了人們對該物種的了解，提高了對嗜肺軍團菌胞內復制、毒力分泌和侵襲的認識。這必將有助于人們理解嗜肺軍團菌的進化方式和流行病學特征，也必將有助于開發新型軍團菌檢測技術和軍團病的治療方法，對于控制嗜肺軍團菌在人群中的爆發和傳播提供有力保障！

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