腸黏膜屏障損傷與保護分子機制研究進展

徐勝 黃順榮

臨床上常見的影響腸黏膜屏障功能的病理因素則包括饑餓、營養不良、嚴重感染、燒傷、休克、嚴重創傷、重癥胰腺炎、梗阻性黃疸、長期全腸外營養、化療及放療等。腸道是危重癥轉向MODS發展的中心器官和始動因素［1］。腹腔感染是內源性感染發生率難以降低的主要原因，而感染主要來源于腸黏膜屏障受損、腸道細菌移居所致［2］。腸功能衰竭參與單器官到多器官功能衰竭的進展過程，而腸黏膜層結構在腸道屏障中發揮著關鍵作用［3］。無論如何，腸道黏膜結構的破壞是腸黏膜屏障損害的基礎。研究顯示，腸黏膜酸中毒、氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、細胞因子和炎癥介質、中性粒細胞粘附等作用，導致腸黏膜萎縮、通透性增高及腸黏膜水腫、腸絨毛高度降低，腸系膜血管收縮、血流量減少，細胞凋亡加速，造成腸黏膜屏障破壞，導致腸功能障礙。為防治腸黏膜功能損傷，學者們針對其保護也開展了大量研究，本文就腸黏膜屏障損傷與保護研究的分子機制研究現狀作一綜述。

一、腸黏膜屏障損傷機制相關因子

（一）內毒素及氧自由基

研究顯示，外科危重癥如重癥胰腺炎、缺血缺氧再灌注損傷等系統性炎癥性疾病發生時，主要器官如胰腺、腸道、肺部等發生一系列組織血流和微循環紊亂、氧化應激，大量氧自由基（oxygen free radical，OFR）和炎癥因子如花生四烯酸代謝產物血栓素A2（thrmboxane A2，TXA2）、前列環素（prostacyclin，PGI2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）等、血管活性物質、毒素等產生、釋放入血，形成不可控性的“炎性瀑布”，導致相應靶器官、靶組織和靶細胞的病理、組織、生理學的改變［4］。

（二）炎癥介質和細胞因子

目前認為發生重癥急性胰腺炎、缺血缺氧再灌注損傷等炎癥疾病時，參與其系統性炎癥進展過程有關的細胞因子主要有白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和TNF-α等。IL-1、IL-6、IL-8作為促炎因子，可作用于白細胞、中性粒細胞，使其激活或釋放溶酶體酶、超氧化物等，促進炎癥進展。IL-10作為抗炎介質，抑制巨噬細胞功能，如TNF-α、IL-1的產生和ROS的釋放。TNF-α 和IL-6則參與了腸道滲透性的功能改變［5］。這些炎癥介質損傷了細胞核酸、蛋白質、脂質等，導致細胞功能障礙、細胞凋亡，使腸黏膜損傷加重，引起腸黏膜屏障功能損害。

（三）核轉錄因子kappa B

核轉錄因子kappa B（nuclear transtription factor kappa B，NF-κB）是一個轉錄因子蛋白家族，為一類能與多種基因的啟動子或增強子κB位點發生特異性結合并啟動基因轉錄的蛋白質，包括 5個 亞 單 位：Rel（cRel）、p65（RelA，NF-κB3）、RelB、p50（NF-κB1）和 p52（NF-κB2）。NF-κB與活化蛋白-1等轉錄因子共同起著中心調節作用。NF-κB的活化是炎性反應早期啟動的關鍵步驟。NF-κB可在轉錄水平調控TNF-α、IL-（1β、2、6、8、12）、誘導型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX2）、趨化因子、粘附分子（細胞間黏附分子-1，E-選擇素，血管細胞粘附分子）、集落刺激因子等多種炎癥介質的基因表達。NF-κB被TNF-a、IL-l特異性受體激活后，可刺激TNF-α、IL-l的產生。這些炎癥因子的增多又促進NF-κB的活化［6］。NF-κB參與炎癥反應的病理生理過程，在其早期局部炎性反應、各種并發癥均起到關鍵作用。NF-κB在重癥胰腺炎及其相關性肺損傷、肝損傷、腸黏膜損傷過程中也發揮著重要作用。

（四）TOLL樣受體（TLRs）和NOD受體通路

哺乳類動物天然免疫是機體抵抗生物入侵的第一道屏障，主要通過模式識別受體識別病原體實現的，包括TOLL樣受體和NOD受體。TOLL樣受體是一種跨膜信號轉導蛋白，其信號轉導通路、免疫調節已受到廣泛研究，已發現TLRs 13種，人類中10種。TLRs能夠誘導NF-κB激活，啟動受NF-κB調控的炎癥因子如IL-6、IL-18等基因轉錄，介導和參與一系列免疫和炎癥反應。TOLR2主要識別革蘭陽性菌、分支菌種屬、細菌脂蛋白等，在急慢性感染中發揮重要作用。TOLR2能和TOLR 1或TOLR 6結合成異質二聚體識別病原體。TOLR4則主要參與脂多糖（革蘭陰性菌細胞壁成分）、類脂A、熱休克蛋白60等信號轉導成果，是宿主識別革蘭陰性菌感染的主要途徑之一。TOLR4識別的鞭毛蛋白是革蘭陽性菌和革蘭陰性菌結構中的必要蛋白組成成分。TOLR 3、7、8、9則表達在細胞內，主要監測和識別病毒核酸。

近年發現的NOD受體蛋白在介導炎癥反應或細胞凋亡信號通路中的重要作用受到較大關注。目前發現NODs蛋白家族成員包括Apaf-I（apoptotie protease activating factor 1）、NODl（CARD4）和 NOD2（CARDl5）。NOD2 可通過信號傳導途徑激活一系列炎性細胞因子如TNF-a、IL-6、IL-1等基因的轉錄，繼而大量表達介導炎癥反應，如阻塞性黃疸、肺部損傷等。NOD2還可通過促進caspases激活，誘導和加強細胞凋亡［7］。NOD2的基因突變往往導致重要的病理生理改變，如克羅恩病、自身免疫性胰腺炎等。臨床調查顯示NOD2/CARD15基因變異的膿毒癥具有更高的死亡率，推測在膿毒癥病人早期NOD2/CARD15基因變異導致腸黏膜屏障功能受損［8］。最近有學者發現在大鼠急性胰腺炎炎癥進展過程中，NOD2在激活胰腺組織NF-κB活化和上調方面發揮重要作用［9］。NOD2可能通過誘導NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及半胱氨酸——門冬氨酸特異蛋白酶（caspases）激活、促進細胞防御素表達等，介導炎癥反應或細胞凋亡信號通路的激活［22-24］。

（五）高遷移率族蛋白B1

高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG），在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力，是一大類富含電荷的低分子非組蛋白染色體核蛋白，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）是其成員之一，HMGB1參與DNA的復制、轉錄和修飾。1999年首次報道HMGB1作為潛在的晚期炎癥介質參與膿毒癥的發病過程，是內毒素致死效應的晚期重要炎癥介質。內皮細胞、巨噬細胞是胞外HMGB1主動分泌方式產生的主要來源。HMGB1也可由壞死細胞被動釋放，是壞死組織激發炎癥反應的主要因子。HMGB1與晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）及Toll樣受體（TLRs）相結合［10］，從而激活下游炎癥通路，參與炎癥病情進展。2012年張等［11］研究認為，血清HMGB1含量可反映急性胰腺炎病情嚴重程度，并可作為判斷其腸黏膜屏障損傷的參考指標。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）能夠負性調節HMGB1的表達［12］，從而減輕炎癥反應。

（六）NADPH氧化酶

NOX2在組織中的表達也最為廣泛，尤其在胸腺、小腸、結腸、脾臟、胰腺、卵巢、睪丸、胎盤的吞噬細胞中。此外，在神經元、心肌細胞、骨骼肌細胞、內皮細胞及造血細胞等非吞噬細胞中，NOX2也存在著較廣泛的表達。研究表明，NADPH氧化酶在氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡通路中均發揮重要作用。YU等［13］在蛙皮素誘導的胰腺炎腺泡細胞AR42J中發現，NADPH氧化酶亞基激活介導了NF-κB炎癥通路激活及IL-6表達，認為NADPH氧化酶通過介導激活NF-κB炎癥通路參與了炎癥因子的表達；NADPH氧化酶可能通過上調凋亡誘導因子，參與蛙皮素誘導的胰腺炎腺泡細胞的凋亡過程［13］。NADPH氧化酶抑制劑DPI可有效抑制其凋亡［14］。在胰腺炎小鼠實驗中，NADPH氧化酶介導了胰內消化蛋白酶的激活過程［15］。近幾年研究顯示，在腦缺血再灌注損傷［16］、膿毒癥［17］、急性呼吸窘迫綜合癥及心臟氧化應激等炎癥反應中，NADPH氧化酶發揮重要的關鍵作用。炎癥反應時，NADPH氧化酶家族發生“氧化爆發”產生大量ROS參與信號轉導、免疫功能、激素生物合成，構成機體抵抗病原體的第一防線。gp91phox（NOX2）是NADPH氧化酶主要的功能亞基，其表達與氧化應激發生相關［18］。

二、腸黏膜保護機制相關因子

（一）腸上皮緊密連接蛋白

緊密連接（tight junction，TJ）是維持腸黏膜上皮細胞間機械屏障的重要結構基礎，一類為細胞膜結構蛋白，如Claudins蛋白、occludin蛋白、連接黏附分子（junction adherensive molecular，JAM）及CAR（cosackie virus and adenovirus receptor）；一類為細胞質蛋白，能與多種蛋白質結合，起連接或信號傳遞作用，多數含PDZ結構域，包含ZO蛋 白（Zonula occludens，ZO-1，ZO-2，ZO-3）、MAGI蛋白（1，2，3）、MUPP1、ASIP/PAR-3 及PATJ等。其功能是調節細胞間物質轉運，允許離子和小分子可溶性物質通過，而不允許微生物及有毒大分子通過，并且相關蛋白分子還參與細胞增殖分化、基因轉錄等過程的信息傳遞和調控，其在腸道屏障功能中地位極為重要。

國內研究表明，大鼠回腸組織中ZO-1表達下調是SAP腸黏膜屏障損傷的重要原因之一，可能與炎性細胞因子TNF-α的過度釋放及DAO活性降低有關。TNF-α可下調腸黏膜上皮細胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達。促腎上腺皮質激素釋放因子（corticotrophin-releasingfactor，CRF）對腸上皮細胞中Ncldn2表達刺激呈劑量依賴效應，并且CRF對腸上皮細胞的這種誘導作用可能與NF-κB激活有關。

（二）細胞外熱休克蛋白（extracellular heat shock protein，eHSP）

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是細胞受熱等因素刺激后誘導產生的蛋白質，是在生物進化中高度保守的蛋白質分子家族，廣泛存在于從原核到真核各種生物細胞內。HSP在正常生理條件下起重要作用，作為分子伴侶參與未折疊新生多肽鏈、多蛋白復合物的組裝和跨膜運輸、轉位、蛋白質降解，細胞內蛋白質合成后的加工等一系列生物活動，保護細胞生存。Hsp70是HSP家族中最重要的一員，誘導性顯著，合成量較多。HSP轉錄上調減少炎癥、氧化和細胞凋亡，保護細胞因子和組織，通過伴侶功能促進應激細胞的活力［19］。HSP70作為細胞內保護者，在胃腸黏膜對抗細胞毒素和細胞應激中發揮“分子伴侶”功能，eHSP70具備免疫系統的“危險信號”免疫調節功能［20］。在胃黏膜中細胞內HSP70在毒素物質致潰瘍形成的機制方面發揮保護作用。胃黏膜損傷和腸黏膜損傷中，細胞內HSP70具保護作用。研究顯示［21］，大鼠嚴重燙傷后腸道中eHSP70和IL-2的表達均降低，且兩者呈明顯正相關。eHSP70可體外促進嚴重燙傷大鼠腸道派伊爾結中CD3＋T淋巴細胞向Th1方向分化，明顯降低其凋亡率，促進其釋放IL-2。在外圍組織創傷（pseudofracture-model，PF）模型和出血性休克再灌注模型中，HSP70的過表達可上調抗炎通路、而抑制炎癥反應，從而減輕腸道內皮損傷以及減輕肝損傷［22-23］。

（三）白介素家族

目前至少發現了38個白介素，它們在生物學上許多具有雙向調節功能。IL-3，4，10，11等在腸道中具有抑制炎癥、保護腸黏膜屏障的作用。IL-3是粘膜肥大細胞增生的調節因子，也有促進小腸隱窩細胞增生的作用。IL-4在腸道中主要是抑制炎癥作用，可抑制單核細胞產生TNF-α、IL-1β。大量文獻認為IL-4與腸道炎癥失衡呈現相關性。IL-11具有腸道保護和腸損傷修復作用。研究顯示rh IL-11在（放化療的腸損傷、短腸綜合征以及炎癥性腸病的治療中發揮重要作用。IL-11可以抑制腸黏膜細胞凋亡、提高腸隱窩干細胞的有絲分裂活性，從而對放化療的腸損傷發揮保護作用。IL-11可促使腸黏膜細胞增殖、增大腸黏膜細胞面積，增強腸吸收功能。rh IL-11抑制前炎性因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ等產生，調控免疫和急性應答，促進黏膜修復。其機制與IL-11下調Caspase-3與Bax表達，上調Bcl-2、PCNA的表達有關［24］。IL-10超家族在腸道中是重要的抑制炎性因子，白細胞介素22（IL-22）是IL-10家族成員之一。在不同的炎癥反應中，IL-22具有促進炎癥病理作用，又具有抑制炎癥修復組織創傷的看似“矛盾”的雙重作用，但其機制復雜；在腸道生物學表現中，它促進抗菌肽的分泌、引起結腸黏蛋白表達增強粘液屏障、促進腸上皮再生等作用［25］。張新艷等［26］研究顯示，IL-22的動態表達對于腸上皮的損傷修復起到十分關鍵的作用；利用基因編輯技術構建了Il-22ra1基因敲除小鼠，發現KO小鼠在DSS誘導的IBD模型中表現出更劇烈的炎癥反應，且恢復更慢，說明在動物體內IL-22通過其受體對腸損傷修復發揮保護功能。

（四）其它保護性調控因子

血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）主要由血管內皮細胞分泌，通過結合HMGB1，激活蛋白C，降低凝血酶的活性而發揮抗炎、抗凝的活性。并且，熱休克轉錄上調TM的表達［19］。CD24在Siglec10的參與下與HMGB1結合、阻斷 NF-κB活化，抑制炎性因子釋放，被認為是HMGB1天然的負性調控受體［27］。在炎癥性腸病中，CD24可能由Wnt信號調節，賦予增強的集落形成能力和增強細胞的運動功能，促進結腸黏膜組織的愈合［28］。

腸內營養、谷氨酰胺、生長激素、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、胰高血糖素樣肽-2（glucagon-like peptide 2，GLP-2）等均可維持腸道功能，誘導腸上皮細胞增生，增加小腸DNA、RNA及蛋白質含量，促進結腸黏膜的增生［29］。其它如中醫中藥，及腸道有益微生物補充、“糞便移植”，也是目前研究的熱點方向。

總體而言，腸道黏膜包含機械、生物、化學、免疫四道屏障，腸黏膜屏障損傷往往是不同機制相互影響、相互作用的。揭示腸黏膜屏障的分子損傷與保護機制，對腸黏膜屏障的基礎與臨床研究意義重大。

[ 1 ] Swank GM，Deitch EA. Role of the gut in multiple organ failure：bacterial translocation and permeability changes [J]. World Journal of Surgery, 1996, 20(4)： 411-417.

[ 2 ] Ammori BJ, Fitzgerald P, Hawkey P, et al. The early increase in intestinal permeability and systemic endotoxin exposure in patients with severe acute pancreatitis is not associated with systemic bacterial translocation： molecular investigation of microbial DNA in the blood [J]. Pancreas, 2003, 26(1)： 18-22.

[ 3 ] Fishman JE, Levy G, Alli V, et al. The intestinal mucus layer is a critical component of the gut barrier that is damaged during acute pancreatitis [J]. Shock, 2014, 42(3)： 264-270.

[ 4 ] Sasaki M, Joh T. Oxidative Stress and Ischemia-Reperfusion Injury in Gastrointestinal Tract and Antioxidant, Protective Agents [J].Journal of Clinical Biochemistry & Nutrition, 2007, 40(1)： 1.

[ 5 ] Xiao YT, Yan WH, Cao Y, et al. Neutralization of IL-6 and TNF-α ameliorates intestinal permeability in DSS-induced colitis [J].Cytokine, 2016, 83(7)： 189-192.

[ 6 ] Satoh A, Shimosegawa T, Fujita M, et al. Inhibition of nuclear factorkappaB activation improves the survival of rats with taurocholate pancreatitis [J]. Gut, 1999, 44(2)： 253-258.

[ 7 ] Poyet JL, Alnemri ES. NF-κB Activation by Card Proteins[M].Nuclear Factor Кb, 2003： 69-88.

[ 8 ] Brenmoehl J, Herfarth H, Glück T, et al. Genetic variants in the NOD2/CARD15 gene are associated with early mortality in sepsis patients [J]. Intensive care medicine, 2007, 33(9)： 1541-1548.

[ 9 ] Qian M, Fang L, Cui Y. Expression of NOD2 in a rat model of acute pancreatitis [J]. Pancreas, 2010, 39(7)： 1034-1040.

[ 10 ] Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, et al. HMGB1 and RAGE in Infl ammation and Cancer [J]. Annual Review of Immunology, 2010,28(28)： 367.

[ 11 ] 張偉杰, 徐桂芳, 田志強, 等. 高遷移率族蛋白B1與急性胰腺炎腸黏膜屏障損傷關系的研究 [J]. 胃腸病學, 2012, 17(11)：669-672.

[ 12 ] Hasegawa A, Iwasaka H, Hagiwara S, et al. Relationship Between HMGB1 and Tissue Protective E ff ects of HSP72 in a LPS-Induced Systemic Inflammation Model [J]. Journal of Surgical Research,2011, 169(1)： 85.

[ 13 ] Yu JH, Kim KH, Kim H. Role of NADPH oxidase and calcium in cerulein-induced apoptosis： involvement of apoptosis-inducing factor [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2006,1090(1)： 292.

[ 14 ] Yu JH, Lim JW, Kim H, et al. NADPH oxidase mediates interleukin-6 expression in cerulein-stimulated pancreatic acinar cells [J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2007, 39(11)： 2063.

[ 15 ] Gukovskaya AS, Vaquero E, Zaninovic V, et al. Neutrophils and NADPH oxidase mediate intrapancreatic trypsin activation in murine experimental acute pancreatitis [J]. Gastroenterology, 2002, 122(4)：974-984.

[ 16 ] 張琛琛. NOX1和NOX4在小鼠腦缺血再灌注損傷中的表達及功能[D]. 2012, 華中科技大學.

[ 17 ] 郭毅斌, 鄭江, 呂根法, 等. MP-1對膿毒癥小鼠的保護作用及其機制 [J]. 中華創傷雜志, 2004, 20(11)： 678-681.

[ 18 ] Lambeth JD. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen [J].Nature Reviews Immunology, 2004, 4(3)： 181.

[ 19 ] Conway EM. Thrombomodulin and its role in inflammation [J].Seminars in Immunopathology, 2012, 34(1)： 107.

[ 20 ] 丁志輝, 張紅艷. 熱休克蛋白70的胃腸黏膜分子伴侶保護作用及免疫調節功能 [J]. 南昌大學學報(醫學版), 2009, 49(1)：136-138.

[ 21 ] 鄧鴻敖, 張紅艷, 熊林朋, 等. 細胞外熱休克蛋白70對嚴重燙傷大鼠腸道免疫功能的影響 [J]. 中華燒傷雜志, 2016, 32(5)：272-276.

[ 22 ] Tsuruma T, Yagihashi A, Matsuno T, et al. The heat-shock protein 70 family reduces ischemia/reperfusion injury in small intestine [J].Transplantation Proceedings, 1996, 28(5)： 2629-2630.

[ 23 ] Afrazi A, Kor ff S, Loughran P, et al. Intestinal Heat Shock Protein 70 (HSP70) Over Expression Attenuates Local and Remote Infl ammation and Organ Injury Following Hemorrhagic Shock and Trauma [J]. Journal of Surgical Research, 2012, 172(2)： 325-325.

[ 24 ] 蔡慧云, 魏曉軍, 齊心, 等. 白細胞介素11調控大鼠NEC腸道增殖與凋亡的分子機制研究 [J]. 中華普外科手術學雜志電子版,2016, 10(4)： 340-343.

[ 25 ] 楊學超, 東傳凌. 白細胞介素22在腸道損傷修復中的研究進展 [J].醫學綜述 , 2016, 22(2)： 242-244.

[ 26 ] 張新艷. IL-22及其受體IL-22RA1在腸上皮損傷修復中的功能研究 [D]. 2015, 華東師范大學.

[ 27 ] 柏超, 陳霞, 李昌平. HMGB1在重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障損傷中作用的研究進展 [J]. 山東醫藥, 2016, 56(34)： 103-105.

[ 28 ] Ahmed MA, Jackson D, Seth R, et al. CD24 is upregulated in infl ammatory bowel disease and stimulates cell motility and colony formation [J]. Infl ammatory Bowel Diseases, 2010, 16(5)： 795.

[ 29 ] 吳國豪. 腸屏障功能障礙及防治對策 [J]. 腸外與腸內營養, 2004,11(5)： 313-316.