微衛星狀態對結腸癌術后輔助化療決策的影響

王暢

結腸癌診治水平不斷提高改善了患者的預后、延長了生存，輔助化療是其中有效策略之一。參照目前的各種治療指南以及循證醫學證據，對于III期結腸癌患者，根治術后行以氟尿嘧啶為基礎的輔助化療已成為一種標準的治療模式，而對于II期患者來說要不要進行術后輔助化療以及采取什么方案進行輔助化療仍存在較大爭議［1-2］。既往研究表明，對于II期結腸癌患者即使術后給予氟尿嘧啶單藥的輔助化療，其5年的絕對生存獲益僅提高2～5%［3-5］，但據2015年一項納入25個高質量研究的Meta分析發現，未接受輔助化療的II期結腸癌患者5年總生存 （overall survival，OS）甚至高于接受輔助化療者［81.4%（95% CI：75.4～87.4）vs. 79.3%（95% CI：75.6～83.1）］［6］。III期結腸癌術后僅接受氟尿嘧啶單藥輔助化療，死亡風險可下降10～15%［7］，在此基礎上增加奧沙利鉑可進一步使死亡風險降低4～6%［8-10］。可見，無論II期還是III期患者，僅部分患者能從輔助化療中獲益，尤其II期患者獲益比例更少，同時考慮到化療還會給患者身體、生活質量、心理、經濟等方面造成的損害，因此如何篩選適合的患者進行輔助化療，以提高有效率，避免過度治療意義重大。

目前尚無理想的輔助化療預測指標，主要仍根據TNM分期和臨床病理復發轉移高危因素來指導治療，但正如前文所述，這并不能滿足精準醫學和實現個體化治療的要求。因此，理想的治療方案應著眼于腫瘤和宿主的分子生物學特征，并結合患者的臨床病理特點綜合決定［11］。目前，對腫瘤分子生物學認識的進展，提示腫瘤相關分子標記物可能更好的識別能從輔助化療中受益的高危群體，其中微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）是當前的研究熱點之一，與結腸癌預后和療效預測密切相關，在早期結腸癌輔助治療及晚期結腸癌免疫治療方面均有重要的參考價值，也是本文要討論的主要內容。

一、結腸癌微衛星狀態概述

（一）微衛星不穩定性

微衛星（microsatellite，MS）是指DNA基因組中2～6 個核苷酸的簡單重復序列，又稱短串聯重復（short tandem repeat，STR），如（CA）n、（GT）n、（CAG）n等，尤以（CA）n重復序列最為常見［12］；MSI 是指由于基因復制錯誤引起基因組中重復序列次數的增加或丟失，導致微衛星片段長度發生了縮短或延長，表現為腫瘤組織與其相應非腫瘤組織DNA結構性等位基因大小發生變化。人類細胞DNA 復制過程中可能整合錯誤的核苷酸，但旋即會被選擇性地從新生DNA 鏈中移除，從而防止子代細胞出現基因突變，這種機理稱為錯配修復（mismatch repair，MMR）。MMR相關基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）異常導致的MMR蛋白缺乏（MMR deficient，d-MMR），從而不能糾正DNA復制錯誤，由此產生MSI。因此，MMR蛋白缺乏是MSI的標志之一。MMR基因缺陷與腫瘤發生密切相關的首例證據是1993 年在遺傳性非息肉性大腸癌（hereditary nonpolyposis colon cancer，HNPCC） 患者中發現的［13-14］。結直腸癌發生發展的遺傳學改變85%是由染色體不穩定驅動的，而15%是由MSI所致，分析MSI的原因一部分是由任意一個MMR基因（MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2）胚系突變所致，而另一部分是由MLH1啟動子區高甲基化所致的表觀沉默，后者主要見于散發結腸癌。

（二）MS和MMR狀態檢測

1997年美國國家癌癥研究所工作組（National Cancer Institute，NCI）推薦通過檢測基因組上的5個微衛星位點（BAT-25，BAT-26，D5S346，D2S123，D17S250）的不穩定性來判斷微衛星不穩定性程度。2個或2個以上位點的不穩定定為微衛星高度不 穩 定（microsatellite high instability，MSI-H）；1個位點不穩定定為微衛星低度不穩定（microsatellite low instability，MSI-L）；無位點出現不穩定定為微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）。另外，MSI也可以通過檢測以下10個不同的微衛星標記點：4個單核苷酸重復序列（BAT25，BAT26，BAT40和BAT34C4），5個二核苷酸重復序列（ACTC，D5S346，D18S55，D17S250和D10197），一個復雜標記（MYCL），MSI-H為存在30%或以上的標記不穩定，MSI-L為存在30%以下的標記不穩定，MSS則沒有存在標記的不穩定。上述兩種檢測及評價方法［15-17］臨床都有應用，以前者多見。亦可通過免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）檢測MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）是否存在（pMMR-即MMR蛋白表達；dMMR即MMR蛋白缺失）將MS 分為非MSI-H與MSI-H。在美國NCCN結直腸癌指南中也指出：免疫組化（IHC）檢測MMR和PCR檢測MSI是應用不同方法檢測同一個生物學效應事件［18］，在CALGB 89803研究中兩者結果一致性高達97.1%［19］。

（三）MSI-H/dMMR結腸癌特點

微衛星狀態與結腸癌臨床分期密切相關，在II期結直腸癌中，MSI-H/dMMR患者約占20%左右，在III期結直腸癌中約占12%，而在IV期中最少，約4%左右［20］。既往的研究表明與多數MSI-L/MSS/pMMR結腸癌相比，MSI-H/dMMR結腸癌具有獨特的臨床病理特點：（1）腫瘤原發部位多位于右半結腸；（2）女性多見；（3）分化程度差；（4）粘液性多見；（5）T分期較晚、腫瘤淋巴細胞浸潤多見；（6）區域淋巴結轉移較少；（7）同時發生BRAF突變較多，約占50%，而KRAS突變較少［21-24］。

二、微衛星狀態在結腸癌中的預后作用和輔助化療療效預測作用

（一）微衛星狀態在結腸癌中的預后作用

2000年Gryfe等使用NCI推薦的MSI定義對607例年齡≤50歲的結直腸癌預后進行分析，發現Ⅰ～Ⅳ期的MSI-H結直腸癌患者對比MSS患者均具有顯著的生存優勢（HR：0.42，95% CI：0.27～0.67，P＜0.001），且無論腫瘤浸潤深度如何，MSI-H者其腫瘤生物學行為具有較低的區域淋巴結轉移率（HR：0.33，P＜0.001）和遠處器官轉移率（HR：0.49，P=0.02）的特點。該研究首次提示MSI是結直腸癌患者的獨立預后因素。Popat等［25］進行的納入7 000余例患者（其中1 277例為MSI-H）共32項臨床研究的薈萃分析結果［26］與之相一致，即無論Ⅱ、Ⅲ期還是Ⅳ期結直腸癌，MSI-H的患者死亡風險較MSS低（Ⅱ～Ⅲ期：HR=0.67，95% CI：0.58～0.78；Ⅳ期：HR=0.64，95% CI：0.46～0.89）。

此后人們進行了一系列MS狀態與結腸癌預后的相關研究，多數研究結果提示MSI對結腸癌的預后作用與臨床分期密切相關。在II期結腸癌中，MSI-H/dMMR是預后良好的標志已被絕大多數研究所證實，基本達成共識；而對于III期結腸癌的預后價值尚存在爭議；對于IV期結腸癌，由于MSI-H例數過少，因此相關結果不能說明其是否具有預后價值。Benatti等［27］對Ⅰ～Ⅳ期的結直腸癌患者進行研究（Ⅱ期患者491例，Ⅲ期461例，Ⅰ期126例，Ⅳ期184例），發現Ⅱ、Ⅲ期的MSI-H 結直腸癌預后較MSS者好，而在Ⅰ期（P=0.363）和Ⅳ期（P=0.66）腫瘤則未得出同樣的結論；2009年美國ASCO年會公布的PETACC3研究結果也支持無論是II期還是III期根治術后的結腸癌，MSI-H比MSI-L/MSS的患者具有更好的無復發生存（relapse free survival，RFS）和OS，并且這種優勢在II患者更為明顯［20］；Sinicrope等［28］研究結果也表明，對于II、III期結腸癌，與pMMR相比，dMMR 組降低了5年復發率（22%vs. 33%；P＜0.001），延長了至腫瘤復發時間（P＜0.001），并降低了遠處復發率 （12% vs.22%；P＜0.001），多因素分析，dMMR是獨立預后良好因素。而以下研究表明微衛星狀態僅對II期結腸癌存在預后作用：2011年，發表在JCO的一項有關CALGB 9581 and 89803的研究結果［29］支持dMMR II期結腸癌患者5年DFS優于pMMR患者，OS有相應趨勢，但未達到統計學意義，對于III期腸癌，微衛星狀態無相關預后作用；2012年，Merokl等［30］研究提示MSI對不同分期的結直腸癌預后意義是不同的，研究納入613 例行R0切除的患者（其中Ⅰ期患者117例，Ⅱ期291例，Ⅲ期188例，Ⅳ期17例），結果顯示，MSI的Ⅱ期結直腸癌患者較MSS患者5年RFS長（P=0.01），而在Ⅲ期患者未得出同樣的結論（P=0.686）；近期，一項來自ACCENT數據庫納入7 803例II、III期結直腸癌的pooled分析顯示［31］：在II期僅接受手術的患者中，dMMR比pMMR患者至疾病復發時間（time to relapse，TTR）（HR=0.27；95% CI：0.10～0.75；P=0.01） 和 OS（HR=0.27；95% CI：0.10～ 0.74；P=0.01）明顯延長，但在III期患者中未觀察到該相關性，提示MMR狀態僅與II期結直腸癌患者預后相關。

MS狀態對結腸癌的預后作用，不僅與臨床分期相關，還與腫瘤原發部位相關。N0147研究結果顯示［32］：在III期結腸癌中，近端結腸（盲腸、升結腸、橫結腸），dMMR較pMMR有更好的DFS（HR：0.71；95% CI：0.53～ 0.94；P=0.018）；但遠端結腸（脾區、降結腸和乙狀結腸）未見差異，反而可能更差（HR：1.91；95% CI：1.11～3.26；P=0.018）；近端pMMR較遠端結腸癌預后更差（adjusted HR：1.27；95% CI：1.08～1.52；P=0.0047）。PETACC-3研究結果顯示［22］：右半結腸癌MSI-H發生率是左半的5倍；無論左半還是右半，MSI-H患者有更好的RFS；在右半腸癌中，MSI-H的患者OS好于MSI-L/MSS患者，而左半腸中無上述表現；對于II期左半結腸癌，MSI-H與MSI-L/MSS的RFS相似；而III期右半結腸癌，MSI-H的RFS明顯好于MSI-L/MSS患者。

MS狀態對結腸癌預后作用的影響與BRAF和KRAS突變的關系。BRAF、KRAS雙野生結腸癌的MSI狀態與RFS和OS無相關性［22］；KRAS突變與否，與微衛星穩定性對結腸癌的預后無明顯相關性；而在CALGB 89803研究［19］中進一步證實：MSI-H/BRAFMT患者中MSI的預后作用被BRAF突變中和，導致與MSS/BRAF WT患者生存時間相同，換言之MSI-H/BRAF WT患者生存更長，MSS/BRAF WT或MSI-H/BRAF MT生存為中等，而MSS/BRAF MT生存最差。

當然，也有少數研究表明MS狀態與結腸癌預后不相關，Kim等［33］探討了微衛星狀態對II期結腸癌患者的預后作用，研究結果表明無相關性。分析MSI在結腸癌預后作用結論不統一的主要原因：（1）MSI-H（dMMR）人群所占比重低，所以納入的研究標本量少，所得證據不充分；（2）用于分析MSI-H（dMMR）狀態的組織標本只能來源于部分臨床研究亞組的患者，因此存在選擇性偏倚；（3）由于用于檢測MSI-H的MSI標記不同，其特異性及敏感性亦不同，由此產生MSI假陽性也是削弱MSI-H（dMMR）的預后好的原因之一。

（二）微衛星狀態在結腸癌輔助化療中療效預測作用

氟尿嘧啶類藥物（卡培他濱或5-FU）±奧沙利鉑是結腸癌術后輔助化療的標準方案。近年，針對微衛星狀態預測上述化療藥物尤其是單藥5-FU有效性的研究逐漸開展，多數研究結果提示dMMR是負性預測因子，但結論尚不統一。

早在 1999年，Carethers等［34］研究了體外dMMR和pMMR結腸癌腫瘤細胞株對5-FU藥物的反應。發現dMMR的結腸癌細胞較pMMR結腸癌細胞在5-FU干擾情況下生長加快，提示MMR蛋白缺乏可能是結腸癌腫瘤組織對抗5-FU藥物的機制之一，此結果在后續的研究中得到證實［35］。從此許多學者開始研究MSI（MMR蛋白）狀態和結直腸癌化療敏感性的相關性。Ribic等［36］對5個前瞻性隨機對照的III期結腸癌輔助化療臨床研究進行薈萃分析，探討微衛星狀態是否是II、III期結腸癌術后單藥氟尿嘧啶療效的預測標記物，結果顯示MSI-H的患者不能從單藥5-FU的輔助化療中獲益，5年生存率提高5%的患者不到1%；而MSI-L/MSS患者可明顯提高生存，死亡風險下降28%，對于II、III期MSI-L/MSS結腸癌患者能夠從術后氟尿嘧啶輔助化療中獲益，而MSI-H患者則不能。Jover等［37］的研究結果進一步支持dMMR的II、III期結直腸癌患者不能從氟尿嘧啶的輔助化療中獲益的結論，多因素分析顯示，MMR狀態是氟尿嘧啶單藥術后輔助化療療效的獨立影響因素。Sargent等［38］的研究結果表明，對于II期dMMR患者，單藥5-FU輔助化療較單純手術相比，OS 還明顯縮短（HR：2.95；95% CI：1.02 ～8.54；P=0.04）；由此說明MMR（或微衛星）狀態與結直腸癌術后輔助化療單藥氟尿嘧啶的療效密切相關，可能是一個負性療效預測指標。然而，也有研究結果不支持MS狀態對5-FU的預測作用。一項納入14個臨床研究的回顧性Meta分析［39］表明5-FU輔助化療可延長結直腸癌的生存，但不依賴于MSI狀態，因此以MSI狀態來指導結直腸癌5-FU單藥化療的治療決策不能使患者生存獲益。

對于III期結腸癌術后僅接受5-FU單藥輔助化療，患者生存獲益較少，在此基礎上聯合奧沙利鉑可進一步提高療效。因此有研究針對III期患者進一步探討了MS狀態對奧沙利鉑以及伊立替康等藥物的輔助化療療效預測作用。在NSABP-C07和N0147臨床研究中，均觀察到奧沙利鉑化療敏感性不受MS/MMR狀態的影響，MS/MMR狀態對奧沙利鉑無療效預測作用，在氟尿嘧啶基礎上增加奧沙利鉑所帶來的生存獲益削弱了微衛星狀態所致的預后差異。在PETACC-3和CALGB 89803兩項研究中，還進一步探討了MS/MMR狀態對伊立替康的療效預測作用，兩者結果有所不同。PETACC-3研究［22］表明接受以FOLFIRI輔助化療的III期患者，療效不受MSI狀態影響；而CALGB 89803研究［19］表明dMMR/MSI-H III期結腸癌患者可能提示以IFL（伊立替康聯合5-FU）輔助化療較5-FU輔助化療更有效。但無論哪個研究，無論微衛星狀態如何，在5-FU基礎上增加伊立替康未能給患者帶來OS的獲益，且毒性增加，因此仍不推薦含伊立替康的輔助化療方案。

三、微衛星狀態對結腸癌術后輔助化療決策的影響

微衛星穩定性狀態檢測能夠為結腸癌患者提供有價值的預后和預測信息，能夠對早期結腸癌術后輔助治療決策的制定有所幫助。鑒于MSI-H/dMMR較好的預后以及對氟尿嘧啶藥物的療效的預測作用，各臨床實踐指南對結腸癌輔助化療的推薦上也有相應的考量。

在2017年最新版本的NCCN結直腸臨床實踐指南中有如下描述［18］：“既往患有直腸癌或結腸癌的所有個體都應進行MMR或MSI檢測”、“II期MSI-H患者預后較好，而且不能從5-FU輔助治療中獲益”、“對于II期結腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決策時需要考量的另一個重要信息就是微衛星不穩定性（MSI）”，并且在輔助治療的臨床路徑中明確把MS狀態作為T3N0M0 II期患者輔助治療與否的重要參考指標，如果是MSI-H或dMMR，則推薦術后觀察，如果是MSI-L/MSS或pMMR且無高危因素，則推薦觀察或臨床試驗或卡培他濱（或5-FU）單藥輔助化療。

在ESMO早期結腸癌診斷、治療和隨訪的臨床實踐指南［40］中指出：“在決定個體患者何時采用輔助治療時，風險評估特別重要；最近研究了幾種新的預測因子，包括微衛星灶的不穩定性（MSI）/錯配修復（MMR）等；目前，最有希望的危險因素是染色體18q 的等位基因缺失（預后不良）和MSI/MMR（預后良好）。特別是MSI/MMR，可用于識別II 期患者中復發風險很低且化療獲益可能性很小的一個小亞組（10～15%）。除了這一預后信息，MSI/MMR狀態不能用于指導治療決定，說明用于評估潛在預測價值的數據具有不均一性。在III 期腫瘤中，MSI/MMR狀態的作用還不確定：較早的研究中有關5-FU 單用的潛在獲益數據和最近分析的結果不一致，而關于奧沙利鉑，目前沒有確切的數據。因此，如果計劃采用奧沙利鉑聯合治療，則無需測定MSI/MMR。”

我國的最新版結直腸癌診療規范中指出：建議有條件者檢測組織標本 MMR 或 MSI，如為dMMR（錯配修復缺陷）或MSI-H（ 微衛星不穩定），不推薦氟尿嘧啶類藥物的單藥輔助化療。

綜合微衛星狀態、臨床分期、病理高危因素及現有循證醫學證據，在結腸癌術后輔助化療方面，個人觀點如下：

（一）MMR影響II期結腸癌輔助化療決策

1.pT3N0M0：首先要看是否存在臨床病理高危因素，即組織分化程度差（合并MSI-H/dMMR除外）；脈管、神經有浸潤；術前合并梗阻、穿孔；淋巴結檢出數小于12枚；切緣陽性或不確定，如果有高危因素，建議輔助化療，并且應用含奧沙利鉑聯合方案，以避免可能的dMMR對5-FU的耐藥。目前針對臨床高危II期結腸癌患者行輔助化療，尚無確切的直接的循證醫學證據支持，如需進一步研究、個體化實施。

2.pT3N0M0：無臨床病理高危因素，再看微衛星狀態，如MSI-H/dMMR，單純觀察即可；如MSI-L/MSS/pMMR，則給予氟尿嘧啶單藥輔助化療。

3.pT4N0M0：建議應用奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶方案輔助化療。

（二）III期結腸癌，是輔助化療的絕對適應證

奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶類藥物是其標準輔助化療方案，患者難以從單藥5-FU輔助化療中獲益，dMMR對決策的影響并不適用于Ⅲ期結腸癌患者。對于不適合使用奧沙利鉑（如過敏等因素）的III期患者，考慮到dMMR/MSI-H患者可能會從含伊立替康方案中獲益，是否基于MSI狀態來選擇性應用伊立替康進行輔助化療，值得進行相關研究，但顯然目前尚不能應用到常規的臨床實踐。

綜上，應用微衛星狀態的檢測結果來指導患者的治療方案的選擇無疑代表了腫瘤個體化治療又向前邁進了一步。然而，在關于MSI與化療效果關系問題的研究中一直存在MSI-H樣本相對不足導致結果缺乏統計學效力的問題，同時，大多數研究均是基于回顧性分析，故可能存在一定程度的選擇偏倚，尚需大量的前瞻性隨機對照研究加以證實。因此，我們在臨床實踐中為患者制定治療決策時，必須結合患者臨床病理特征、分子生物學特征以及治療意愿、經濟條件等因素綜合考慮、個體化實施。同時也希望發現更多的有價值的分子生物學標記物聯合應用，富集適合治療的人群，真正實現高效低毒的治療原則，使患者獲益。

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