慢性阻塞性肺疾病動物模型研究進展

蔣超文 陳琰 王斌

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見的以持續呼吸系統癥狀和氣流受限為特征的疾病，通常與有毒顆粒或氣體的顯著暴露引起的氣道和/或肺泡異常有關[1-2]。2018年最新流行病學調查研究結果顯示，我國COPD疾病負擔非常重，總患病人數已達9 990萬，約占全球COPD患者的25%，其中，20歲及以上成人COPD患病率為8.6%，40歲以上人群患病率則高達13.7%[3]。在全球范圍內，COPD是第四大死亡原因，預計到2020年，COPD將會超越下呼吸道感染而成為僅次于缺血性心臟病和腦血管疾病的第三大死因，給全球公共衛生帶來很大負擔[4]。

為了研究COPD的發病機制和有效的臨床治療方法，國內外雖然進行了很多研究，但是取得的進展有限，目前仍未能完全闡明其發病機制。動物實驗是研究COPD的重要手段和途徑，雖然動物疾病模型只能模擬COPD的一部分特征，但是其確實可以提高我們對COPD生理、病理生理和治療的基本機制的認識，建立穩定可靠的動物模型是實驗成功的前提條件。本文就目前各種常用的COPD動物模型及其研究和應用綜述如下。

一、實驗動物的選擇

大鼠、豚鼠、小鼠、小型豬、家兔、猴子以及犬是目前用于建立COPD模型的主要動物，其中，最常用的是大鼠和豚鼠。

1大鼠： 大鼠生命周期短，繁殖力強，性情較溫馴，飼養繁殖成本較低，而且目前已經對大鼠基因組研究得很清楚。由于大鼠基因組與人類基因組非常相近，比較適合用于建立COPD動物模型。但應用大鼠建立COPD模型也有其局限性：①大鼠的肺分左右葉，左肺僅一葉，右肺4葉；②大鼠氣管黏膜下的腺體無杯狀細胞，支氣管的分支少，這些特征與人類不太相符；③有研究表明，大鼠對煙熏誘導的COPD樣損傷抵抗力較強等[5]。

2. 小鼠： 小鼠作為動物模型的優點與大鼠相似。其缺點主要包括：①因支氣管和細支氣管無杯狀細胞及缺乏黏液下腺，導致濾過功能較低；②無呼吸性細支氣管；③建立模型所需時間比較長，難以維持且評價肺功能困難，且損害程度存在品系差異[6]。

3. 小型豬： 小型豬目前被認為是較理想的用于建立COPD模型的動物。小型豬的肺分葉明顯，結構與人類很相似，左側2葉，右側3葉，而且小型豬也有呼吸性支氣管， COPD模型中氣道阻力增加的最重要原因的就是這些小氣道阻力的升高；小型豬的氣道黏膜下腺體相對發達, 更容易感染，因此誘導COPD模型相對容易成功；此外，小型豬的氣道直徑較大，便于實驗操作[7]。

4. 豚鼠： 豚鼠與大鼠相似。豚鼠的肺不僅在解剖學及生理學上與人類較為相似，而且對過敏原的反應也與人類有很多相似之處，因此也常被用于構建COPD 模型[8-16]。

5. 猴子： 猴子與人類同屬靈長類動物，其肺組織結構和功能與人類最為接近，其病理生理、發病機制也與人類相似，因此，用猴子來復制COPD模型相比其他動物有獨特的優勢。猴子被認為是研究人類COPD發病機制的最合適做模型的動物[17]。其不足之處在于: ①體型偏大，實驗操作較為困難；②購買、飼養、繁殖和藥物使用的成本高；③生命周期長，繁殖速度慢，繁殖數量相對少，導致研究周期長[18]。

6. 犬： 犬暴露在香煙煙霧之后導致的慢性支氣管炎和肺氣腫的病理和病理生理學變化與人類較為相似，而其作為COPD動物模型的不足之處與猴子相似。目前犬已經被廣泛用于建立支氣管哮喘和COPD的動物模型[19]。研究證實，短時間內直接吸入香煙煙霧可使犬產生肺氣腫和肺纖維化[20]。

二、建立COPD動物模型的常用方法

目前國內外建立COPD動物模型的方法主要是通過將實驗動物暴露于蛋白水解酶、香煙煙霧、炎癥刺激物(如LPS)和基因調控來誘導產生。

1. 蛋白水解酶誘導的COPD模型： 研究表明，蛋白酶-抗蛋白酶失衡是引起COPD病理類型中肺氣腫的主要原因。在被確診為α1抗胰蛋白酶缺乏癥的患者中，大部分患者同時患有肺氣腫[21]。這一發現是肺氣腫胰蛋白酶-抗胰蛋白酶假說的基石。當肺內蛋白酶負荷超過抗蛋白酶時，彈性蛋白酶被降解，最終導致肺氣腫的發生[22]。后續的研究則進一步證明，向嚙齒動物大鼠氣管注入彈性蛋白酶可誘導其再現肺氣腫的主要病理特征[23]。常用的蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶等。

毛旻等[24]把10只小型豬隨機分為模型組(n= 6)和對照組(n=4)，模型組采用氣管內注入木瓜蛋白酶的方法復制肺氣腫模型。實驗方法具體如下：麻醉小型豬后行氣管插管，測定各組肺功能、血氣、電子計算機斷層掃描(computed tomography, CT)，模型組支氣管鏡下左肺葉內注入5 ml(6 U/kg)木瓜蛋白酶，對照組支氣管內注入5 ml生理鹽水，每周1次，于第五周測定各組肺功能、分析血氣、檢測并評估左右肺葉的CT值，最后對比分析兩組小型豬血氣、肺功能、CT值的情況。實驗結果證明小型豬支氣管鏡下左肺葉內注入木瓜蛋白酶能成功復制豬肺氣腫模型。

采用蛋白水解酶誘導COPD模型這種方法的主要優點是我們可以通過調整蛋白水解酶的灌注劑量來控制COPD的嚴重程度，缺點則是彈性蛋白酶在COPD中的作用依賴于多種病理生理機制，從而增加了臨床事件的數量[25-27]。

2. 煙霧吸入誘導的COPD模型： 吸煙已被公認是COPD的最主要的病因。大鼠、小鼠和豚鼠等都可以用煙霧吸入誘導COPD模型的建立。曹君等[28]把20只C57BL/6J小鼠置于自制熏煙箱進行煙熏，每天煙熏4次，每次6支香煙煙熏15 min， 持續90 d，最后成功建立了肺氣腫模型。該COPD模型穩定可靠，其病理學改變與人類COPD相似。

煙霧吸入法誘導的COPD模型具有COPD的許多疾病特征，包括肺內巨噬細胞、中性粒細胞浸潤、氣道纖維化以及肺氣腫，但是不同動物種類或者同種動物不同品系對香煙煙霧的敏感程度不一，而目前還沒有標準的動物暴露方法[29-31]。

3. 內毒素誘導的COPD 模型： 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 存在于革蘭陰性菌中，可以誘發氣道慢性炎癥，通過對模型動物氣道內反復滴注LPS可構建COPD動物模型。Stolk等[32]通過向金黃地鼠氣管內反復滴入LPS成功建立了LPS誘導的COPD模型，并推斷肺氣腫形成的重要原因是LPS引起的中性粒細胞聚集及蛋白酶釋放。該研究發現，反復滴入LPS 8周后即可觀察到肺氣腫形成。此外，另有多項研究也成功的應用LPS誘導了其他鼠類COPD模型[33-35]。

COPD 是一種慢性的病理過程，由氣道炎癥到氣道重塑，逐步導致持續性通氣功能障礙，而LPS誘導的肺氣腫是在短時間內造成肺及氣管的損傷,所以LPS誘導的肺氣腫只是復制出COPD的部分特征[7]。

4. 基因調控的COPD 模型： COPD是一種多基因病，遺傳易感性是其重要的危險因素。通過對動物某一特定基因進行調控的方法來建立 COPD 模型是近年來興起的一種新方法。Iizuka等[36]采用煙霧吸入法成功在Nrf2-/-小鼠中誘導出COPD模型。Churg等[37]將腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)敲除小鼠(TNF-αR-/-)長期暴露于煙霧后成功復制了COPD小鼠模型。

α-1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, AAT)缺乏是COPD最常見的遺傳因素， 人類只有一個編碼α-1抗胰蛋白酶的基因，而小鼠有6個，所以建立AAT缺乏癥相關COPD小鼠模型非常困難。 Borel等[38]最近成功地運用第三代基因編輯技術(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技術創建了這種小鼠COPD模型。

基因調控的COPD動物模型為研究者提供了一個新的方向，將會有越來越多的研究采用基因調控的動物模型來研究COPD的發病機制。

5. 其他方法誘導的COPD模型： 由于COPD發病機制尚未完全闡明，發病過程較為復雜，目前尚無統一的、公認的COPD動物模型建立方法。為了盡可能真實地模擬COPD 的發病過程，許多研究者采用多因素聯合誘導COPD動物模型。比較常用的是LPS經氣管內注入加香煙煙熏法。宋小蓮等[39]將24只8周齡Wistar大鼠隨機分成3組，每組8只。其中1組作健康對照，另2組分別進行單純香煙煙熏和香煙煙熏加氣道內注入LPS兩種方法建立COPD模型。結果發現，雖然兩種方法都可以成功建立大鼠COPD模型，但是采用香煙煙熏加氣道內注入LPS方法建立的大鼠COPD模型病理生理改變與人類COPD特征更為相似。此外，還有氣道內注入LPS和促彈性蛋白酶以及氣管內滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法等其他建模方法。

三、展望

COPD發病機制十分復雜，建立穩定可靠的動物模型是研究COPD發病機制的重要基礎和前提條件。而在COPD動物模型構建中，單因素誘導的模型有許多方面不太符合人類COPD發病過程和病理生理改變，所以采用復合因素誘導的動物模型越來越多。隨著COPD動物模型的發展和新的研究方法的建立，研究者在COPD的發病機制及其治療方法的研究中一定會取得更大的進展 。