未折疊蛋白反應與肺部疾病關系的研究進展

唐為安 徐興祥 楊俊俊

肺與外界直接接觸，外界刺激如粉塵、氣體、微生物容易導致肺內細胞產生大量錯誤合成蛋白，此時為保持細胞內蛋白平衡，內質網產生內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)促進錯誤蛋白進行正確折疊并降解無法折疊的蛋白，短暫的ERS有助于細胞恢復穩態，但是長期和高強度的ERS可以導致肺部許多疾病的發生。未折疊蛋白反應(unfold protein response, UPR)是ERS最主要的反應，主要分為三個途徑：醇需要型跨膜激酶1(inositol needs transmembrane kinase 1, IRE1)、雙鏈RNA激活蛋白激酶樣ER激酶(PKR-like ER kinase, PERK)、激活轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)，三種通路相互補充又相互制衡[1]。研究UPR和肺部疾病的聯系，有利于更好地了解肺部疾病，本文現就UPR與肺癌、肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺纖維化的聯系進行綜述。

一、UPR與肺癌

肺癌是威脅人類的第一大腫瘤，肺癌細胞常常面對極端環境如缺血、缺氧、新陳代謝改變，為了應對這些極端因素細胞自身也產生相應的變化，引起UPR通路激活。細胞為滿足快速分裂的需要，不斷合成大量新的蛋白，容易導致錯誤蛋白大量積蓄引起細胞UPR，UPR的產生也有助于腫瘤細胞在極端環境的存活。

1. 大細胞癌： 大細胞肺癌屬于非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)的一種，其調節機制與UPR通路的激活有關。Ahmadi等[2]發現UPR中的反應標志物GRP78對大細胞肺癌的調節十分重要，通過PCR檢測發現在大細胞肺癌患者的腫瘤組織中，UPR激活標志物GRP78的表達是陰性對照的三倍以上，miR-495和miR-199a-5p都能夠促進腫瘤細胞的惡性轉變，在細胞中增高的GRP78能下調NSCLC中miR-495和miR-199a-5p，過表達或者抑制miR-495和miR-199a-5p也能夠顯著改變GRP78的表達和XBP1水平，可見UPR和microRNA互相影響共同促進癌癥的發生。順鉑是治療肺癌最經典的化學治療藥物之一，然而癌癥耐藥性的存在降低其療效，研究發現中度UPR能夠加強肺腫瘤的生長和轉移，并增加肺腫瘤細胞的耐藥性。Shi等[3]通過在鉑類化療藥處理24h后的大細胞肺癌細胞H460中，加入ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)或牛磺熊去氧膽酸鈉(tauroursodeoxycholate, TUDC)，通過MTT實驗發現細胞活力大大下降，細胞內caspase-3基因和胞漿內細胞色素C明顯上調，并極大的促進了細胞的凋亡，證實了化療藥物可以導致UPR的激活并增強腫瘤細胞的耐藥性，其機制可能是細胞中PERK和IRE1均發生了磷酸化，導致細胞對于蛋白處理能力上升有關。

2. 腺癌： 腺癌大多起源其小支氣管，早期無明顯臨床表現，其發生往往伴隨著UPR通路的激活。Yang等[4]發現在2D培養和3D培養中肺腺癌細胞中能誘導轉錄因子XBP1的高表達，促進體外3D培養中肺腺癌細胞的增殖，通過敲除在XBP1表達可以阻斷Tm/Tg誘導的細胞增殖，同時LOX基因作為是XBP1的關鍵下游效應物，敲低LOX表達可阻斷XBP1誘導的細胞增殖，可見XBP1可以通過LOX調節肺腺癌細胞的增殖。貝伐珠單抗廣泛應用于中晚期腫瘤的臨床一線治療，其機制主要是抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)來治療肺癌，有研究顯示貝伐珠單抗能夠通過利用UPR的凋亡機制促進肺癌細胞的死亡，提高治療效率。Wang等[5]發現隨著貝伐珠單抗的濃度增加，其UPR凋亡基因CHOP表達成正比升高，貝伐珠單抗可能通過加劇UPR反應來促進A549細胞凋亡。來自海星的細胞生長抑制劑海星皂甙1具有多種生物活性，其抗腫瘤的機制也很可能與UPR激活有關。Zhao等[6]發現海星皂甙1增加ER擴張和胞質Ca2+濃度，并以劑量和時間依賴的方式增強UPR標記物GRP78和GRP94的表達，增加了CHOP、caspase-4和JNK三種基本的UPR相關凋亡分子表達，最終抑制A549細胞的增殖并促進細胞凋亡。

3. 肺癌免疫監控： 研究發現UPR通路有幫助腫瘤細胞逃避免疫監控。髓系來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)常常在機體中起到免疫抑制的作用，MDSC能夠直接抑制NK細胞也能夠抑制CD4+和CD8+細胞介導的免疫反應。研究顯示MDSC活性的激活與其細胞內部UPR通路激活密切相關。Cubillos等[7]發現MDSC中UPR的激活可以直接發生在應激的腫瘤微環境中，也可以從相鄰發生UPR的癌細胞傳播，UPR通路激活的MDSC能夠抑制免疫細胞對肺癌細胞的攻擊，通過抑制MDSC中ER應激傳感器和UPR質可以將MDSC重編程，促使其成為保護性抗腫瘤免疫的細胞。預防UPR反應的抑制劑如TUDCA和4-PBA已經在臨床前癌癥模型中顯示出有希望的治療效果，通過抑制MDSK中UPR通路激活可以成為癌癥免疫療法的新干預措施。

二、UPR與肺部感染

肺部感染是肺部最常見的一類疾病，UPR信號在感染導致的炎癥因子分泌中具有重要作用。由于炎癥細胞往往具有大分泌需求，因此特別依賴于發育良好且大量的內質網，感染導致的刺激可能誘發細胞內的UPR反應。炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-6也可以引起纖維肉瘤細胞中UPR三條通路激活，從而引起肺部炎癥的急性期反應，UPR激活與感染互相促進又互相拮抗[8]。

1. 急性肺炎： 急性肺炎反應的病因有很多種，其中急性肺損傷是其中重要的一個原因。在急性肺損傷導致的急性肺炎中，UPR通路激活對細胞自噬以及凋亡起到了重要的作用。Zeng等[9]為了鑒定脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的急性肺損傷小鼠模型中肺部炎癥的細胞機制，通過添加經典UPR抑制劑4-PBA觀察對UPR和自噬的影響，在LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型和人肺泡上皮細胞模型中，4-PBA阻止了NF-κB通路的活化，降低了促炎介質TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，4-PBA通過抑制UPR通路減輕了炎癥的激活，其機制很可能與PERK-eIF2α介導的翻譯減緩促進炎癥通路NF-κB的激活有關，表明UPR是LPS誘導炎癥的關鍵啟動子。4-PBA導致細胞自噬降低，其通過經典的AKT/mTOR信號通路在急性肺炎中起保護作用，通過細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)加劇了LPS誘導的A549細胞毒性，可見4-PBA抑制急性肺炎模型中UPR激活和自噬產生保護作用。UPR可以刺激NF-κB通路的激活，導致游離NF-κB可轉位到細胞核中，其機制可能是IRE1α自磷酸化誘導其細胞質區域發生構象變化，與銜接蛋白TNF-α受體相關因子2結合，IREα-TRAF2復合物招募IκB激酶并磷酸化IκB，導致IκB發生降解和NF-κB核轉位[10]。

2. ABPA： 煙曲霉(aspergillus fumigatus, AF)的致敏作用與嚴重過敏性肺部炎癥有關，過敏性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA)就是過敏性真菌病中最為常見的一種疾病。臨床研究發現過敏性支氣管肺曲霉病患者的肺組織中葡萄糖調節蛋白GRP78增加。Lee等[11]發現UPR與AF患者轉導通路之間存在聯系，使用Af暴露小鼠顯示肺中UPR相關蛋白GRP78表達大量升高，線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mtROS)大量產生，施用UPR抑制劑改善了AF誘導的過敏性炎癥，可見UPR在AF誘導的過敏性肺部炎癥中被激活，敲除磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K-δ)也能夠抑制UPR的激活，并且減少mtROS的產生和氣道的高反應性，在原代培養的氣管上皮細胞中，也可以通過阻斷PI3K-δ抑制AF誘導的UPR反應。這些發現表明PI3K-δ通過UPR調節AF誘導的過敏性支氣管肺曲霉病，可見UPR是ABPA產生的一個關鍵步驟。

三、UPR與肺纖維化

肺纖維化是以炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病，是由正常組織修復過度導致了成纖維細胞大量增生，細胞外基質異常堆積造成的。細胞激活UPR信號通路以維持內質網穩態，但是UPR同時也是一把雙刃劍，短時間UPR雖然有利于維持細胞蛋白平衡，當UPR時間過長或刺激太強后，能夠導致肺部細胞功能受損甚至凋亡。

1. IPF： 常見的以肺纖維化病變為主要表現形式的疾病類型為特發性肺纖維化(idiopathic fibrosis of the lung, IPF)，是一種能導致肺功能進行性喪失的嚴重的間質性肺疾病，目前病因不明。肺實質中有許多細胞包括肺泡上皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等都在IPF發展的過程通過UPR產生影響。肺泡內的細胞主要分為Ⅰ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cellsⅠ, AECⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cellsⅡ, AECⅡ)，Ⅱ型肺泡上皮細胞是維持肺泡完整性所需的祖細胞群，AECⅡ功能喪失和凋亡被認為是IPF初始階段和發展的重要過程[12]。KORFEI等[13]從IPF、COPD和正常器官供體三組患者外周移植肺組織取樣分析，通過蛋白檢測發現IPF中的AECⅡ能夠產生大量的ATF-6、ATF-4和CHOP等UPR相關蛋白，但在COPD和正常器官供體中不存在，可見在IPF患者中UPR激活可以導致處于纖維化部位內面的肺泡II型上皮細胞自我凋亡并被纖維組織取代。Kropski等[14]通過表達突變表型活性蛋白C或者衣霉素誘導UPR激活，使得博來霉素誘導的IPF小鼠模型中AEC死亡和肺纖維化增強，可見UPR激活可能會使AEC脆弱性增高，導致肺部損傷增強和IPF發生。UPR雖然不能直接促進IPF的發生，但是可以提高患者IPF發病的概率。Lawson等[15]通過在小鼠的AECⅡ表面活性蛋白C上過表達L188Q，6個月后發現UPR通路被激活，雖然并沒有導致肺部纖維化的發生，但這些小鼠被博萊霉素刺激后，表現出更強的肺纖維化能力和細胞凋亡能力，證明UPR通路的激活并不足以激活肺部纖維化，但是對于IPF的發生具有重要作用。在許多IPF患者中，人們發現皰疹病毒與IPF的發生密切相關。皰疹病毒經常在IPF肺中發現并且可以誘導UPR。Lawson等[16]在23例IPF患者的AEC中發現皰疹病毒蛋白表達，并且發現孢疹病毒蛋白和UPR標記共定位，皰疹病毒感染也可以直接促進UPR激活，使得患者存在免疫功能下降誘導惡性肺纖維化和IPF發生。

2. CF： 囊性肺纖維化(cystic fibrosis, CF)患者的氣道表現出持續強烈的炎癥反應，肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage, AMs)在CF患者的的發病機制中起關鍵作用，部分AMs細胞可以分泌大量炎性介質如誘導TNF-α和IL-6的產生。UPR中XBP1被IRE1通路信使RNA剪接后影響外周巨噬細胞，產生炎癥作用。Lubamba等[17]發現CF患者AMs中UPR通路激活XBP1表達大量增加，同時發現LPS與UPR通路中轉錄因子XBP-1的水平升高相聯系，在培養的dTHP-1細胞中敲除XBP-1降低了CF患者的炎癥反應，可見CF患者中的炎癥因子可以由UPR中的XBP-1表達調控，CF患者中AMs通過上調XBP-1介導的細胞因子促進對CF患者氣道的炎癥的發生。

四、UPR與慢性阻塞性肺氣腫

雖然UPR導致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的功能目前尚不明確，但是研究發現在COPD患者的細胞中發現了UPR通路激活的現象[18]。COPD常與吸煙相關，吸煙暴露會損害蛋白酶體本身，導致大量不溶解蛋白在氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和巨噬細胞中大量積聚，引起細胞產生UPR。

1. 慢性支氣管炎癥： 慢性支氣管炎患者粘液細胞增多，常常分泌大量粘液。氣道杯狀細胞的IRE1β對于粘液細胞表型和分泌粘液素5AC(mucin5AC，MUC5AC)和粘液素5B(mucin5B，MUC5B)具有重要作用。研究表明低氧刺激可以激活分子伴侶GRP78的解離，激活UPR修復細胞的蛋白酶和自噬功能。Min等[19]發現磷酸化的eIF2α和chop蛋白在COPD患者的肺組織中表達升高，然而IRE1和ATF6通路則沒有發現明顯的變化，磷酸化的eIF2α和chop蛋白改變對于氣道的阻塞具有直接關系。然而并不是每一個COPD患者都會出現UPR通路的激活，Tran等?[20]在COPD患者檢查中并未發現UPR通路信號分子GRP78、XBP1、CHOP等蛋白表達升高，意味著僅在一部分COPD人群中，UPR通路被激活。囊性纖維化跨膜電導調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是氯通道和上皮功能的關鍵調節因子，氣道中CFTR功能的喪失會導致粘液增厚，減少粘膜纖毛清除，慢性感染和呼吸衰竭。UPR在轉錄、翻譯和成熟水平能夠降低CFTR表達，UPR引發ATF6與CFTR的最小啟動子的結合導致CFTR轉錄被抑制，并對對組蛋白脫乙酰化和啟動子甲基化，降低CFTR的表達[21]。

2. Nrf2： 抗氧化核因子E2相關因子2(antioxidant nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)：Nrf2缺乏和UPR激活常常存在于嚴重的COPD中，NrF2與UPR互相拮抗。研究報道PC12細胞UPR激活時上調Nrf2介導的血紅素加氧酶(haem oxygenase, HO)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)表達增加，HO和GCLC又會導致COPD的病情加重[22]。Nrf2與UPR在COPD患者中的作用相互影響，實驗發現抑制Nrf2信號通路能夠明顯減弱COPD患者和暴露在吸煙環境中的小鼠UPR激活，并且提高了機體對于低氧的抵抗[23]。雖然Nrf2能夠提高UPR的表達，但是Anna等[24]采集COPD患者和非COPD患者的外周血單核細胞，進行實驗發現Nrf2的表達量在COPD患者中大量升高，UPR通路未有明顯變化，這可能與COPD患者的病情程度有關。

五、UPR與哮喘

支氣管哮喘是一種伴有氣道反應性升高的慢性炎癥，長期的炎癥、低氧等因素的刺激容易導致UPR的激活，并與氣道炎癥反應互相協同[25]。氣道上皮細胞內鈣離子濃度、透明質酸、粘蛋白分泌等因素都受到UPR的調節作用。

1. 哮喘： 目前認為在支氣管哮喘發病機制中，UPR與氣道上皮細胞的透明質酸與黏蛋白的異常分泌、鈣穩態失調、炎癥細胞趨化等環節都密切相關。Kim等[26]通過對哮喘患者的外周血單核細胞和支氣管肺泡灌洗液檢測，發現UPR標識蛋白GRP78表達顯著升高，UPR通路很可能通過激活NF-κB導致哮喘的發生。UPR除了直接影響肺泡細胞，還能夠刺激免疫細胞的活性。Zhang等[27]研究發現，用姜黃色素處理的T細胞可誘發UPR中PERK和IRE1通路激活，引起CD4+淋巴細胞和T淋巴細胞中刺激轉錄因子XBP-1和CHOP上調，最終引起T細胞的凋亡。在哮喘患者的氣管上皮細胞中，輔助性T細胞2型(Helper T cells2，Th2)可以分泌IL-4和IL-13導致ATF6上調，而ATF6則提升了內質網鈣泵活力與SERCA2b基因表達，最終影響氣管平滑肌細胞的增殖與重塑，刺激哮喘癥狀加重[28]。

2. ORMDL3： 血清類黏蛋白1樣蛋白質3(serum mucin 1 like protein 3, ORMDL3)ORMDL3在哮喘的發病機制中屬于關鍵基因，能夠調節細胞內鈣離子濃度和UPR的激活。Moffatte等[29]證明ORMDL3基因影響UPR并導致哮喘發生，ORMDL3基因通過調控肌漿中鈣離子通道導致磷酸化eIF2α減少，而鈣離子ATP泵的減弱又能夠引起氣道的重塑和高反應性，這是哮喘發病機制的標志之一。Cantero等[30]發現ORMDL3表達增加UPR反應，UPR的效應基因及相關信號通路均明顯上調，如使用敲除ORMDL3基因后內質網釋放鈣內流的離子減少，UPR作用也相應減弱。由于哮喘患者中ORMDL3基因的表達增高，其機制很可能是通過調劑UPR通路影響鈣離子濃度造成的。

綜上所述，UPR是細胞對于自身蛋白控制的一種途徑，能夠針對外界刺激產生的差錯調節細胞內穩態，并影響體內細胞自噬和凋亡途徑。UPR影響肺部疾病的范圍十分廣泛，不僅僅與上述幾種肺部疾病有關，臨床發現UPR還影響肺部急性損傷、肺缺血再灌注損傷等疾病。然而目前UPR對于肺部疾病的發病機制并沒有完全查明，仍然需要大量的研究。了解UPR與肺疾病發病機制的聯系，有助于為未來的肺部疾病的診斷治療治療提供新思路。