早期肺癌檢測的研究進展

任麗麗 金發光 劉小北

肺癌(carcinoma of the lungs)是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，在世界范圍內，肺癌的患病率和病死率都居首位[1-2]。調查結果顯示，2015年國內肺癌的發病數為733 300例，死亡數為610 200例[3]，2015年，全球新增肺癌患者1 987 909例，因肺癌死亡者多達1 732 185例[4-5]。從上述兩組數據表明，肺癌的患病率和病死率非常接近。盡管醫學界對肺癌進行了病因學研究及腫瘤遺傳學調查，而且對肺癌的診斷及治療等方面進行了不少改進，但在過去數十年間，肺癌病死率仍急速攀升，而總體生存率仍然相當低。我國肺癌5年生存率僅為16.1%[6]，世界范圍內肺癌5年生存率也僅為18.1%[7]。造成肺癌患者生存率低與不良預后的原因，主要是大多數的肺癌患者在發現癥狀時都已經到了晚期，腫瘤已經轉移。研究表明早期肺癌，如中央鱗狀細胞原位癌(central squamous cell carcinoma in situ)和腺體原位癌(adenocarcinoma in situ)卻預后良好[7-8]。對早期肺癌的篩查與檢測是改善肺癌生存率的關鍵，現就肺癌的早期檢測研究進展作一綜述。

一、血清腫瘤標志物檢測用于肺癌早期診斷

血清腫瘤標志物是廣泛存在于惡性腫瘤細胞，或由惡性腫瘤細胞產生的物質，或是宿主對腫瘤的刺激反應而產生的物質，并能反映腫瘤發生、發展，監測腫瘤對治療反應的一類物質。目前較為確定的，在臨床中常用的肺癌標志物包括：①癌胚抗原(carcinoembryomic antigen, CEA)，CEA是在肺癌檢測中較為常用的腫瘤標志物，大量研究證明CEA升高有助于肺腺癌的診斷，以及CEA升高與腫瘤病理學類型相關和臨床分期呈正相關[5，8]；②神經特異性烯化酶(neur-specific enylase, NSE)，又被稱為烯醇酶(enolase)或γ-烯醇酶(γ-enolase)，檢測血清NSE水平可以協助診斷小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，同時血清NSE水平可用于SCLC的分期及預后判斷[9-10]；③細胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragments, CYERA 21-1)是由多種上皮細胞和癌上皮細胞分泌產生，在肺癌組織中，CYFRA 21-1含量增高，尤其是在肺鱗癌中有高表達，研究發現轉移性肺癌化療前的血清樣本，CYFRA 21-1高的患者預后不良[11]。鱗癌患者的血清CYFRA 21-1水平顯著增高，CYFRA 21-1對NSCLC的敏感性為59.6%，特異性為90.5%[12]；④表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是最重要的分子生物腫瘤標志物之一，特別是對基因突變預測及肺癌靶向治療的療效判斷，早期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)腫瘤組織及淋巴組織存在EGFR高表達，通過與hTERT結合，EGFR mRNA即成為診斷與評估肺癌臨床分期的生物標志物[13]。

肺癌腫瘤標志物在不同的個體中差異很大，這主要是肺癌的病理類型對腫瘤標志物的變化具有很大的影響，同時還受到技術條件的限制，在肺癌患者中檢測的敏感性和特異性尚有一定的局限性。如何將分子生物學的技術用于肺癌早期診斷，提高早期肺癌的檢出率是當前研究的熱點之一。通過尋找和應用有效的篩選方法，有望提高肺癌的早期診斷，現已發現，核內不均一核糖核蛋白(heterogenous nuclear ribnucleoprotein, hnRNP)，該物質為存在于細胞核的一種RNA結合蛋白，被認為是有效的標志物。研究證實肺癌細胞株和手術切除的肺癌組織均有表達，而正常的支氣管上皮和肺泡上皮細胞的細胞核則沒有hnRNA蛋白表達，FHIT基因微衛星缺失、端粒酶和DNA的甲基化等。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測與新的敏感基因檢測技術結合對痰液、支氣管肺泡灌洗液(broncholveolar lavage fluid, BALF)和血液腫瘤標志物進行檢測，也為肺癌早期診斷提供了依據[14]。

二、影像學檢查用于肺癌早期診斷

1. 低劑量螺旋CT掃描： 低劑量螺旋CT(low-olose computed tomography, LDCT)具有常規CT的敏感性，但是射線輻射劑量較常規CT要低很多。一次常規胸部掃描輻射量為3～27 mSv，是胸部X線片10～100倍，而LDCT掃描輻射劑量僅為常規CT的26%，顯著降低了受檢查者的輻射劑量[15-16]，對肺內小結節的檢出率是常規X線胸片的10倍[2]。研究證明，LDCT在肺癌高危人群進行肺癌篩查能降低20%的肺癌死亡，因此，是肺癌的早期診斷和早期治療、提高肺癌患者的生存率，降低病死率的重要措施[3，17]。一組研究對817例吸煙者進行LDCT檢查，發現了肺癌18例[18]，另一組研究發現，LDCT篩查組中肺癌年病死率為247/10萬，而X線篩查組中肺癌年病死率高達309/10萬[17]，研究結果發現LDCT較X線胸片有更高的早期癌檢出率，可顯著提高肺癌的生存率[18]。

當臨床上進行LDCT檢查發現肺部結節時，應詳細描述結節所在肺內的部位、結節大小、密度、鈣化和形態。既往有影像檢查結果者需與進行比較。如果發現肺部結節無法進行確診的患者，應進行觀察隨訪，隨訪頻率和持續時間，應根據結節大小和其性質以及是否肺癌高危人群等因素，對于沒有肺癌高危因素而有可能手術的患者，LDCT隨訪的頻率應以結節大小而定[14]：結節直徑≤4.0 mm者，每年進行一次LDCT隨訪；結節直徑4.0 mm～6.0 mm者，12個月內對肺結節重新評估，如果結節沒有變化，以后每年進行一次LDCT隨訪；結節直徑6.0 mm～8.0 mm者，6個月至1年內進行一次LDCT隨訪，如果結節仍然沒有變化，18個月至2年內再進一次LDCT檢查，以后每年進行一次LDCT檢查；結節直徑>8.0 mm者，如果結節還沒有變化，則采用傳統的隨訪頻率，即每3個月、6個月、12個月和24個月各進行一次隨訪，以后每年根據結節變化情況進行隨訪。

2. 正電子發射計算機斷層掃描： 正電子發射計算機斷層掃描(positrom emission computed tomography, PET/CT)是核醫學發展的一項新技術，PET/CT是同機具有多層螺旋CT和PET的圖像融合設備。PET/CT是一項醫學影像學的革命技術，是一項在肺癌篩查及全身其他臟器腫瘤篩查和診斷中常用的重要檢查，其對癌癥的診斷具有重要作用，尤其在肺癌的診斷、分期以及療效評價方面，具有較高的敏感性及特異性[19]。其特點是PET能提供病灶功能與代謝等分子信息和CT能提示病灶解剖定位，以其兩者結合等優點，能夠早期、快速、準確地發現腫瘤，并且能夠確定腫瘤的性質，與常規CT檢查比較，其對肺結節特性檢查的敏感及準確性均較高。但由于示蹤劑18F-氟代脫氧葡萄糖(fluordeoxyglucose,18F-FDG)的代謝特點，有一定的假陰性和假陽性。近年來，新型示蹤劑18F-氟代胸苷(18F-fluoro thymidylic,18F-FLT)極大地提高了肺癌早期診斷的準確率[20]。因此，18F-FLT對肺癌診斷的特異性明顯高于18F-FDG。另外，還有多種特殊示蹤劑單獨或聯合使用有望進一步提高肺癌早期診斷的準確性。

3. PET-磁共振成像： PET-磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)是兩者融合一體的新型大型影像診斷設備，是功能影像與分子影像學發展的最前沿技術之一，并具備PET和MRI的檢查功能，可實現解剖與功能影像最大程度的優勢互補[21]。其中MRI可提供清晰的解剖定位、優良的軟組織對比、清晰的波譜功能信息、更高的對比分辨率和血流動態圖像，其對肺部、縱隔、胸壁等部位病變判斷有較大優勢[22]。PET-MR是隨著科學技術的進步和臨床與科研的需要應運而生，目前PET-MR的臨床應用主要是集中在腫瘤、心臟疾病及腦神經科學等領域中[23-24]。PET-MR可用于認知損害疾病的早期診斷，并可對其病因進行鑒別診斷，特別是對腫瘤的診斷與分期、療效的評價等具有應用價值。隨著核素快速標記技術、分子生物、核化學和分子藥理學的快速發展，PET-MR顯像劑的研發將取得長足的進步，并將逐漸應用到細胞代謝、細胞受體、細胞衰老和細胞凋亡，以及核酸和基因等領域，可以預見PET-MR將具有廣闊的臨床應用前景。

三、電子支氣管鏡檢查用于肺癌早期診斷

1. 高倍電子支氣管鏡： 高倍電子支氣管鏡技術(high magnifiction bronchovideoscope, HMB)是將兩個檢測系統融為一體，視頻觀測系統用于高倍率觀測和纖維觀測系統用于支氣管鏡頂端定位。視頻觀測系統是一種物鏡光學系統，可實現高倍率觀測，放大倍數約比傳統電子支氣管鏡高四倍之多。在電視監視器上可隨時觀察高倍鏡下的支氣管黏膜，并運用纖維觀察系統定位。HMB可插入氣管支氣管樹，直至確定其病變區域，隨后將支氣管鏡頂端靠近支氣管黏膜，在監視器上觀察高倍放大的支氣管黏膜[25]。HMB還能夠很方便的檢查支氣管黏膜中的微血管網，可區分支氣管炎與黏膜異型增生。與支氣管炎相比，支氣管異型增生具有顯著的血管面積比。在螢光氣管鏡異常螢光區域，HMB比單獨使用螢光氣管鏡能更準確地檢測出組織異型增生。

2. 高清支氣管鏡： 高清支氣管鏡檢查(high-definition bronchoscopy, HDB)是一種用于觀察支氣管表面的改良成像技術，其畫面可達到高清電視圖像質量。目前已有幾種高清支氣管鏡與圖像改良的視頻處理器已應用于臨床。BF-H290與LUCERA ELITE視頻系統中心CV-290結合使用，圖像清晰，可用于對支氣管表面進行詳細而精確的觀察。與自體熒光成像(autofluorescence imaging, AFI)電子支氣管相比，配有高清支氣管鏡的表面強化技術的EB1990i及Pki-700對于氣管內血管畸形的檢測效果更佳[26]。

3. 自體螢光氣管鏡： 自體螢光氣管鏡檢查(autofluorescence bronchoscopy, AFB)是一種檢測正常黏膜與惡變黏膜之間的自體熒光區別技術。當用藍光(440～480 nm)照射時，正常的支氣管黏膜熒光表現為紅(>630 nm)綠(520 nm)兩色，病變部位的熒光呈淡棕色，而高級別異型增生或癌前病變呈紅棕色。異常病灶使綠色自體熒光衰減的原因為：①支氣管黏膜增生；②由于缺氧引起的核黃素增長。紅色自體熒光增強是由于癌組織內過度血管化和血流豐富導致卟啉增加所致[27]。AFB能夠檢測到白光支氣管鏡無法發現的異常病灶。激光誘導熒光內鏡加白光支氣管鏡檢測上皮內腫瘤病變相對靈敏度可達到6.3，檢測浸潤性癌的靈敏度可達到2.71。自體熒光內鏡(SAFE)1000系統使用氙燈(420～480 nm)與感光濾色片。自體熒光內鏡(ASFE)3000系統能夠同時使用氙燈/感光濾色片與單色二極管激光器。D-型熒光反射系統使用氙燈(380～460 nm)AFI電子支氣管鏡系統更是融合了3個信號：藍光(395～445 nm)、激光自體熒光(460～690 nm)，以及兩個不同波段的反射光：綠光(550 nm)與紅光(610 nm)[28]。

4. 窄帶成像技術： 窄帶成像技術(narrow band imaging, NBI)檢查與使用傳統寬帶藍(400～500 nm)、綠(500～600 nm)、紅(600～700 nm)三色濾波器的白光支氣管鏡相比，窄帶成像技術使用窄帶濾波器。窄帶成像使用兩個窄頻帶：藍(390～445 nm)與綠(530～560 nm)。這兩個窄頻帶能夠穿越黏膜下層微血管結構，并實現其可視化。NBI圖像增強技術可實現支氣管血管結構的重點與精確觀察。在幾種支氣管血管形態中，扭曲血管、點狀血管、螺旋狀血管反映了癌變過程中血管生成的發生[29]。有研究者進行Meta分析，窄帶成像技術顯著提高了診斷癌癥前氣道病變的靈敏性，特異性以及診斷優勢比[30]。窄帶成像技術診斷靈敏性達80%，特異性達84%。NBI+AFI提高了診斷正確率，靈敏性為68%，特異性為75%。NBI除檢測癌變前氣管病變外，NBI還能夠區分病理類型、區分鱗狀組織結構(鱗狀上皮化生、鱗狀上皮異型增生或鱗狀細胞癌)與腺瘤。有研究表明，點狀血管形態多為腺癌組織結構，而扭曲血管或突然中斷血管形態多為鱗狀組織結構[31]。

5. 共聚焦激光顯微內鏡： 共聚焦激光顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy, CLE)系統是一種運用共焦熒光顯微技術原理的新型成像技術，可以提供細胞水平在體成像[32]。CLE系統可提供對細胞與亞細胞結構的詳細分析，并高度精準預測非腫瘤性病變，其靈敏度為96.0%，特異性為87.1%，準確性為91.0%[33]。將CLE的顯微內鏡圖像與傳統組織病理學圖像對照，可發現不規則結締組織結構以及代表細胞巢下層結締組織熒光的斑點狀陰影或“黑洞”(black holes)，而這或與惡性腫瘤的診斷關系密切[34]。

細胞內鏡系統(endocytoscopy system, ECS)是一種無需共焦探頭的綜合顯微內鏡技術，可實現實時超高分辨率細胞樣式體內診斷[35]。顯微內鏡(XEC-300)配備有光學放大透鏡系統、電荷藕合器件以及4.2 mm的活檢通道。ECS在進行支氣管鏡檢查時可實現放大570倍，視野300×300 μm，穿透深度0～30μm，空間分辨率4.2 μm的功效。在其進行檢查觀察過程中，發現正常支氣管黏膜中含有纖毛柱狀上皮細胞，鱗狀異型增生黏膜中可見胞漿豐富的表層細胞，而在鱗狀細胞癌中可見細胞密度增加并呈不規則分層狀的多形性癌細胞。ECS影像與光鏡檢查常規組織結構的結果非常吻合，ECS有助于區分正常支氣管上皮細胞，異型增生細胞與惡性腫瘤細胞[36]。還有研究結果表明，ECS(XEC-120-U)在支氣管內窺鏡檢查中被用于SCLC患者體內診斷。ECS可實現小圓形和橢圓形藍色細胞的病灶區可視化，從而實現組織病理學對SCLC體內診斷。達到早期肺癌的診斷。

6. 氣管鏡腔內超聲： 目前臨床上可用的氣管鏡腔內超聲(endobronchial ultrasound, EBUS)有兩種： ①凸探頭EBUS在氣管鏡頂端發出線性探測超聲波，用于肺門及縱隔淋巴結以及與支氣管毗鄰的縱隔病變取活檢；②圓徑探頭EBUS可為獲取影像插入柔性氣管鏡通道的機械超聲探頭，臨床上用于肺周邊病灶成像。現已開發出幾種圓徑探頭EBUS與導向鞘系統，并配合臨床使用。最常使用的是20-MHz圓徑探頭EBUS(UM-S20-17S)，外徑1.4 mm(1.4- mm探頭)。更大的20-MHz圓徑探頭EBUS(UM-S20-20R)，外徑1.7 mm(1.7- mm探頭)也可用于被認為使用更大通道支氣管鏡可以到達的所有病灶。圓徑探頭EBUS可提供高分辨率360度的支氣管周邊結構以及周圍性肺病灶圖像[37]。最近一項Meta分析結果表明，圓徑探頭EBUS平均診斷率可達70.6%，優于常規氣管活組織檢查[38]。在不同的臨床研究中，圓徑探頭EBUS診斷率在49.4%至92.3%之間[39]。圓徑探頭EBUS被頻繁使用得益于與幾種導航和引導手段的配合應用。超細支氣管鏡(ultrathin bronchoscopy)與虛擬支氣管鏡(virtual bronchoscopy)檢查導航再加上圓徑探頭EBUS診斷率可在77.0%[40]，而電磁導航支氣管鏡(electromagnetic navigation bronchoscope)與圓徑探頭EBUS配合使用，對肺癌早期診斷率可高達88.0%[7]。

四、一些用于肺癌早期診斷的前沿性檢測方法

1. 呼出氣體冷凝液： 呼出氣體冷凝液(exhaled breath condensate, EBC)的收集完全為無創，收集樣本方法簡便。呼出氣體包含了無數揮發性化合物，如氧氣、氧化一氧、二氧化氮、乙烷、戊烷以及非揮發性化合物，如氣道內的小型無機離子、尿素、核酸、有機酸，氨基酸，多肽，蛋白質，表面活性劑以及大分子物質[41]。隨著微陳列技術的發展、新一代測序技術，以及生物信息學檢測的應用，現今已能夠從非常小的樣本中(如EBC)識別基因的改變[42-43]。結合GATA6與NKX2-1，基于分析基因表達與特定分子變化為基礎的肺癌診斷實驗，現今已達到了98.3%的高靈敏度與89.7%的高特異性[44]。對于進行創傷性或微創肺癌診療程度有困難的肺癌患者，EBC生物標記診斷法可能更具有特別重要的臨床意義。因為EBC收集完全無創，操作簡易，適用于所有患者，無需考慮患者的不良反應，而且實際上并無任何不良反應。

2. 支氣管基因分類器： 新近研究發現，患肺癌的吸煙者支氣管基因表達發生了變化[45]。對于這些與癌癥相關的基因表達譜的檢查或有助于肺癌的診斷[46]。有學者通過使用標準支氣管鏡的細胞刷從支氣管上皮細胞中獲得了RNA樣本，并從中獲取RNA微陳列與基因表達分類器(gene expression classifier, GEC)用于預測肺癌基本癌癥基因組合的可能性。GEC對于預測存在中度肺癌的可靠性約為10%～60%，對支氣管鏡檢查結果不確定的病例，支氣管基因分類器(bronchial genomic classifier, BGC)顯示具有高靈敏度(88%～89%)，而對于肺癌陰性預測值可達91.0%[47]。有研究表明，與單獨使用支氣管鏡靈敏度的74%～76%相比，BGC+支氣管鏡檢查提高了靈敏度，可達96%～98%[47]。GEC是對近支氣管上皮細胞進行測量，而非以肺部病灶內的細胞測量。從細胞學角度分析，正常的氣道內基因表達的能力，對于早期肺癌檢測成為了可能。

3. 胸腔鏡手術/導航手術： 盡管目前已開發出一些微創診斷程序，如支氣管鏡檢查，但對于高度疑似肺癌的低風險患者，當患者病灶不適用其他檢查診斷程序時，采用外科活檢依然是被推薦的選擇[48]。在診斷肺周邊病灶選擇手術切除的理由是避免微創診斷方法的低陰性預測值(negative predictive value, NPV)陷阱。而小于1.5 cm的肺部病灶支氣管鏡檢總體靈敏度僅為13.5%[49]。與開胸手術比較，胸腔鏡手術(video-assisted thoracic surgery)減少了肺部手術患者術后住院時間及并發癥[50]。胸腔鏡手術/導航手術(navigation surgery)同時能對肺部目標病灶進行診斷與治療。胸腔鏡肺部活檢可對無法觸診的磨玻璃結節或不在胸膜附近的不可見病灶進行定位。現已開發了幾種結節定位技術，如CT引導下的微型線圈插入術(microcoils)、金屬夾(metallic clip)、定位導絲針(hook-wire)、亞甲藍(methylene blue)、碘油(lipiodol)，以及超聲波掃描(ultrasonography)等[51-55]，對于早期肺癌的診斷都具有臨床意義。

五、展望

在過去的十余年間，早期肺癌的檢測取得了很大的進步，無疑對早期肺癌的診斷有顯著提高，而且病死率似乎也有下降趨勢[2]。創新支氣管鏡診斷技術的發展提高了肺癌早期檢測的效率。支氣管鏡光活檢(bronchoscopic optical biopsy)可能會在未來替代傳統的組織診斷活檢。隨著檢測轉向周邊小型腺癌(small-sized adenocarcinomas)，導航支氣管活檢(image-guided fransbronchial biopsies)，如圓徑探頭超聲支氣管鏡以及導航支氣管鏡，也已成為早期肺癌診斷的重要手段。此外，支氣管基因分類器與呼出氣體冷凝液技術或有助于早期肺癌的診斷與篩查。