自噬與腦卒中的研究進展

葉櫻澤 熊曉星(綜述) 古麗娟(審校)

自噬是指真核細胞內的自噬體將胞內變形、衰老或損傷的細胞器和生物大分子包裹轉運至溶酶體腔中消化降解的過程，是維持細胞內環境穩態和細胞周期的一條重要代謝途徑。自噬的正常完成是真核細胞維持自穩狀態的基礎，自噬的缺陷或過度激活會導致機體許多疾病的發生。最新研究發現，在神經系統疾病中自噬的過度激活可促進神經元損傷。腦卒中是由于腦血管阻塞(缺血性腦卒中)或破裂(出血性腦卒中)引起的腦局部血液循環障礙和腦組織結構功能紊亂的一類疾病，其可導致嚴重的認知、運動、感覺等功能異常，甚至出現較高的致殘率和致死率。相關研究報道，在發生腦卒中的病理條件下自噬過度激活、不足或缺陷均可促進細胞死亡[1-2]。

自噬是真核細胞維持內環境穩態的重要機制，它能否正常完成是機體內多種生理和病理過程的基礎，同時它與許多疾病的發病及預后密切相關。缺血性腦卒中作為一種導致人類較高致殘率和病死率的疾病，其發病機制尚不完全明確，而自噬在腦卒中中可能會過度激活或抑制，與腦缺血后細胞死亡信號通路的激活以及炎性反應等有關。本研究就自噬在缺血性腦卒中中的作用進展作一綜述。

1 自 噬

1.1 自噬的概念、成分及形成過程

自噬是指維持真核細胞內環境穩態的一條重要途徑。在正常生理條件下自噬保持在基本水平，對機體有保護作用，但在多種應激條件下如饑餓、缺氧、線粒體損傷、炎癥反應和病原體感染等[3]均可誘導自噬過度激活，從而損傷組織細胞。在自噬的整個過程都由自噬基因(autophagy-related gene，Atg)編碼的自噬相關蛋白調控。迄今為止，已有Atg1-34共34個自噬基因被成功克隆，任何一種Atg的缺失或突變都會導致自噬異常或者無法發生[4]。

細胞自噬的經典形成過程包括起始、前自噬體(pre-autophagosomal structures,PAS)形成、延伸閉合、成熟、自噬溶酶體形成和降解等幾個步驟[5]。細胞受到外界應激條件的刺激后自噬在起始信號的調控下被激活，細胞質內形成1個雙層膜杯狀結構的PAS；在自噬相關蛋白的調節下PAS不斷延伸包裹形成的球狀自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，并在溶酶體內的水解酶作用下將其包裹的內容物消化降解成氨基酸或多肽等物質重復利用維持內環境的穩態。此外,自噬溶酶體將底物降解完成后從頂端伸出1個管狀結構，斷裂后形成原溶酶體,接受新的溶酶體水解酶,逐漸形成成熟的溶酶體,完成溶酶體再生。近年來研究發現，自噬對受損的細胞器或蛋白質進行識別并可選擇性地包裹和清除[6-7]。

1.2 自噬的信號調控

自噬的精準調控對細胞應對外界環境的刺激至關重要，多種信號分子在自噬的形成過程中發揮調控作用，主要包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Beclin-1、AMP依賴的蛋白激酶(adenosine5,-monophosphate-actived protein kinase，AMPK)、p53、Rab7等信號轉導通路。

1.2.1 mTOR途徑調控的自噬

mTOR是一種在進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通常以兩種復合體的形式存在：mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)。前者主要參與調節細胞生長、細胞周期進程和細胞程序性凋亡等，而后者在細胞骨架蛋白的構建和細胞存活中發揮重要作用。mTOR還可感受細胞內多種信號分子的變化，是自噬啟動階段的關鍵調節因子，常通過抑制Atg1/ULK1蛋白酶復合物的磷酸化狀態，從而抑制自噬的發生[8]。

1.2.2 Beclin1途徑調控自噬

Beclin1蛋白作為另1個自噬相關蛋白，主要在起始階段發揮重要作用，在自噬啟動時它與VPS34、Atg14蛋白形成三聚體后不斷地招募自噬相關蛋白推動自噬的進行。Beclin1與下游自噬相關因子結合形成復合物后可正向或負向調控自噬水平，但具體的功能機制尚未完全清楚。通常認為Beclin1與Bcl-2、VPS34等因子結合形成的復合物最常見[9]。Bcl-2是一種常見的凋亡抑制因子，與Beclin1結合形成復合物，促使Beclin1從p150/VPS34復合體中解離出來，抑制Beclin1依賴的自噬通路，負向調控自噬水平。Liu等[10]研究發現，死亡相關蛋白激酶能通過與Bcl-2競爭結合位點，促進細胞自噬，而VPS34作為細胞自噬的激活因子，與Beclin1結合后形成的復合物可正向調控Beclin1信號通道，上調細胞自噬水平[11]。

1.2.3 其他相關途徑調控的自噬

AMPK作為調節細胞代謝的一種蛋白激酶，在缺血缺氧等應激條件下被激活后可參與自噬的發生，主要通過AMPK-磷酸化結節硬化癥復合物2(tuberous sclerosis complex,TSC2)/mTOR調節相關蛋白- mTORC1等兩條通路使mTOR活性被抑制，從而誘導細胞自噬的發生[12]。

作為“分子警察”的p53，雖是目前人類發現的與腫瘤發生相關性最高的抑癌基因，但近年研究發現p53對自噬具有調節作用，Gauster等[13]研究發現通過藥物抑制p53活性能使機體細胞自噬水平升高。

Rab7是GTP酶超家族的成員之一，主要在自噬形成的后期即自噬體的成熟階段起決定性作用，Zhan等[14]研究發現同型融合及液泡蛋白分選復合物與Rab7-GTPase可相互調控，并在自噬體與溶酶體膜融合期間調節Rab7的活性狀態，從而影響自噬體的成熟和溶酶體的形成，維持溶酶體的功能，催化自噬泡與溶酶體融合。

2 缺血性腦卒中與自噬

缺血性腦卒中是由于局部供血中斷造成該血管供應區的腦組織缺血缺氧所致的一類疾病，可導致一系列嚴重的病理生理變化，不僅包括神經元不可逆損傷，還可引發神經元自我修復。除了細胞凋亡、壞死這兩種主要的方式，自噬也參與其中，但其具體機制尚未完全清楚。

2.1 自噬在缺血性腦卒中的激活和調控機制

2.1.1 自噬在缺血性腦卒中的激活

神經元作為體內一種特殊的細胞類型，對糖原的儲存極少，所以正常情況下它的自噬水平較低，自噬體的生物合成也較少，但在發生缺血性腦卒中或腦缺血再灌注損傷時中樞神經系統的自噬就可能被激活。1995年Nitatori等[15]首次在沙土鼠短暫性腦缺血模型內用電子顯微鏡觀察到海馬CA1區細胞的自噬體，發現自噬被活化后不斷有學者對自噬在腦缺血中的激活與調控機制進行進一步研究。2009年Puyal等[16]在小鼠短暫性局灶性腦缺血模型中發現神經元的溶酶體和自噬泡活性增強。2015年Youle等[17]在研究腦缺血后自噬水平的變化時發現缺血能激活自噬。

2.1.2 自噬在缺血性腦卒中的調控機制及相關信號通路

當發生腦部血管局部中斷后周圍的細胞缺血缺氧，自噬被激活，但調節腦缺血中自噬活化的信號通路非常復雜，主要包括Ⅲ型PI3K-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,Akt)-mTOR、AMPK-mTOR、Beclin1-Bcl-2復合物、活性氧(reactive oxygen species，ROS)-線粒體自噬、UVRAG-VPS16-Rab7，缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)等信號通路。

在發生缺血性腦卒中時腦部血管局部中斷，神經元的糖代謝途徑供能減少，糖異生增多導致氨基酸減少，最終出現生長因子生成減少，后者可通過Ⅲ型PI3K-Akt-mTOR途徑誘導細胞自噬[18]。III型PI3K-Akt在靜息狀態下普遍存在于細胞質內，但細胞受到生長因子的刺激后就被激活聚集到細胞膜上，激活下游Akt磷酸化，后者可磷酸化TSC2，減弱對小G蛋白Rheb(Ras homolog enriched in brain)的抑制作用。小G蛋白Rheb活化后可激活mTORC1信號通道，負向調控自噬的激活。所以，在腦缺血時PI-3KIII-Akt-mTOR途徑的激活對自噬起到負向調控作用[19]。

Bcl-2蛋白家族作為凋亡抑制因子，是缺血性腦卒中后神經元凋亡的重要調控器，包括破壞線粒體膜電位和促進細胞色素C釋放的促凋亡蛋白(Bax、Bcl-XS、Bak、Bid和Bad)及與之功能相反的抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-XL)。在發生腦缺血時細胞內營養物質缺乏，Bcl-2通過結合Beclin-1形成復合物，抑制Beclin1依賴的自噬通路，減少自噬的發生，從而減少缺血缺氧導致的細胞死亡及腦組織損傷[19-20]。

在細胞發生缺血缺氧時HIF-1被激活后參與自噬的形成[21]。HIF-1由誘導型ɑ亞基和組成型β亞基兩部分組成。缺氧時細胞內的泛素化被抑制，誘導ɑ亞基堆積和β亞基發生二聚化，形成更多的HIF-1，HIF-1可以激活和轉錄細胞內多種缺氧反應基因，如促紅細胞生成素、血管內皮生長因子、葡萄糖轉運蛋白1、α-腺病毒E1B及Bcl-2相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus e1binteracting protein 3，BNIP3)等。其中BNIP3可以通過與beclin-1競爭結合Bcl-2而誘導自噬發生[22]。同時，HIF-1的激活也可以促進線粒體BNIP/BNIP3L的表達增多，后者與Beclin1競爭結合Bcl-2/Bcl-XL，導致游離的Beclin1增多，后者與多種蛋白結合形成磷脂酰肌醇3激酶復合體，調節自噬蛋白在自噬前體結構中的定位，誘導自噬[23]。

在細胞發生嚴重的缺血缺氧時線粒體的功能或結構可能受到損傷，能量供應減少而促進AMPK磷酸化，通過AMPK-mTORC1通路來促進自噬的發生[24]。神經細胞線粒體功能損傷后胞內ROS急劇增多[25]，可通過兩條途徑調控自噬：(1)氧化半胱氨酸殘基的催化位點激活ATG4的蛋白水解活性，調控自噬的形成；(2)使線粒體氧化損傷，發生功能障礙和結構損傷，誘導發生線粒體自噬。同時線粒體結構損傷后胞質內的Ca2+濃度升高，導致AMP/ATP比值增加，進而激活AMPK-TSC2-mTORC1的途徑來進一步調控細胞自噬水平。

2.2 自噬在缺血性腦卒中的雙重作用

盡管有明確的研究證明自噬在缺血缺氧后被激活，但其病理變化過程仍然存在著很多爭議。大量的研究證實，自噬通過促進損傷蛋白質和細胞器的清除而在缺血性腦卒中中發揮神經保護作用，從而有利于能量的循環利用和細胞防御。但是，這些研究結果卻難以解釋腦細胞死亡的上升指數與自噬活動的增強成正比的現象，這就引發了在腦卒中時自噬的激活是否最終導致病理改善或惡化等問題。

諸多研究發現，自噬在缺血引起的神經元死亡中具有保護作用，但機制仍不清楚，其可能通過降解壞死或損傷的神經突觸為神經元提供能量，也可能通過降解細胞中的耗能產物以維持細胞內離子平衡，從而延遲神經元死亡。Chauhan等[26]亦觀察到腹腔注射雷帕霉素后減小大鼠局灶性腦缺血后的梗死體積，提示自噬對缺血性腦卒中具有保護作用。

然而，也有研究發現過度激活的自噬可以加重腦損傷，抑制自噬有利于局灶性腦缺血再灌注后神經組織損傷的恢復。Wang等[27]研究發現在嚴重腦缺血的大鼠中用自噬抑制劑3-甲基腺苷(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬，可阻止海馬CA1區神經元發生程序性死亡，從而有助于保護神經元， 提示自噬對缺血腦組織具有損傷作用。Gong等[28]人將自噬基因Atg7缺失和正常新生鼠的腦永久性缺血模型對比后發現Atg7缺失能更有效地減少神經元的自噬性死亡，減輕腦損傷，表明抑制自噬具有腦保護效應。

3 出血性腦卒中與自噬

出血性腦卒中是由于腦部血管結構異常或非外傷性血管破裂所導致的一類疾病，主要包括腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)及蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)兩種類型。與缺血性腦卒中比較，出血性腦卒中占的比例較小，對它的研究也相對較少。盡管已經證實自噬在許多疾病的發生中起到重要作用，但在出血性腦卒中中的確切影響和作用尚未完全清楚。近年來有研究發現自噬在出血性腦卒中后細胞的病理生理變化過程中也發揮了重要作用。Kong等[29]研究發現，腦出血后自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達水平顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調，Beclin1/ Bcl-2比值增大，說明腦出血可以激活自噬。Sarkar等[30]研究發現，在中樞神經系統發生急性損傷時腦白質內活化的小膠質細胞中自噬體增多。Chen等[31]用雷帕霉素處理腦出血小鼠模型后小膠質細胞的激活被抑制，TNF-ɑ表達下降，表明自噬可能抑制小膠質細胞的炎性反應，發揮神經保護作用。因此，研究發生出血性腦卒中后機體對于自噬的調節機制，并通過調節自噬干預腦出血引起的細胞死亡，可能會成為治療出血性腦卒中患者有效的輔助方法。

4 展 望

腦卒中作為發病率和致殘率較高的一類疾病，可導致嚴重的認知、運動和感覺功能障礙。自噬在兩種不同類型的腦卒中的作用機制不同，其結果也不盡相同。自噬在腦卒中中到底是扮演損傷還是保護的角色，取決于細胞內外的應激程度及細胞自噬的內部反應機制，并且很可能在腦卒中整個進程的不同時段發揮不同效應。因此，通過不同空間、時間動態觀察以及從多方面、多層次、多角度研究腦卒中后自噬的發生發展過程，探索自噬調節的信號通路及分子機制，了解自噬在腦卒中不同情況下發揮的相應作用，有助于為以自噬激動或抑制劑調控自噬為靶點防治腦卒中開辟新思路，也為今后能以不同類型腦卒中、不同個體、不同時間進程等個性化精準治療腦卒中提供可行性。

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