誘導多能干細胞源性神經干細胞用于治療腦梗死的現狀

劉爽 張卓伯

自誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)被發現以來它在神經系統疾病的應用越來越廣泛。本研究通過查閱文獻的方法對iPSC及其衍生物神經干細胞(neural stem cells NSC)移植治療腦梗死的方法、結論進行概述，為干細胞移植治療腦梗死提供理論依據。

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral infarction)，是指因腦組織局部血液循環障礙，缺血缺氧引起的神經功能障礙性疾病[1]。神經細胞是一種永久細胞，一旦壞死后不可逆轉，腦梗死的發生會導致神經功能的缺損甚至威脅生命。腦梗死在我國的發病率很高，約為110/10萬人口，腦梗死患者的病死率較高、生活質量較差，對家庭和社會造成的負擔較重。目前多采用藥物或介入手術治療，尚未發現任何一種治療可以完全恢復神經系統的功能。近些年來科學發現人類胚胎干細胞移植是一項新穎而有潛力的治療腦梗死的方法，已有動物實驗表明移植入小鼠體內的胚胎干細胞具有多分化性，可以分化為神經細胞，并且具有高度的自我復制能力，替代死亡的神經細胞而發揮功能[2]。但是，由于胚胎干細胞需要使用胚胎細胞，存在倫理道德爭議，且異體移植會產生免疫排斥反應，所以研究受到了限制。2006年誘導多能干細胞的發現解決了這一問題，日本Yamanaka[3]研究小組利用Oct3/4、Sox2、C-Myc 和Klf4 4種轉錄因子重新編碼小鼠胚胎成纖維細胞，成功獲得了生物特性與胚胎干細胞非常相似的細胞，稱為誘導多能干細胞。

iPSC相比于傳統的細胞重編程手段具有極大的優勢。(1)iPSC受體細胞可來自體細胞，不需要使用卵母細胞或胚胎，可避免倫理及免疫排斥兩大問題；(2)來源廣泛。可以取自人B淋巴細胞[4]、肝細胞、胃細胞[5]、神經細胞[6]等多種組織器官；(3)操作簡單，具有重復性。取材可以來自患有特定疾病的患者，從而實現患者個體化。例如可以取來自于患神經退行性疾病患者的皮膚細胞，如肌萎縮側索硬化癥或帕金森氏病[7]，分化提取所需要的細胞類型，如運動神經元、多巴胺能神經元[8]，這使得人們在研究疾病發展的細胞和分子水平上達到了一個新高度；(4)增殖能力高。許多類型的細胞如神經細胞只能進行有限數量的增殖，而重新編程后得到的iPSC仍然是二倍體細胞。這讓iPSC技術迅速取代了傳統的重編程手段, 向臨床應用更近一步。

1 iPSC和NSC應用于治療腦梗死

腦梗死與其他神經系統退行性疾病不同，腦缺血發生后血管內皮細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、神經元都在一定程度上發生了破壞和死亡，因此與帕金森病只需要一種細胞不同，治療腦梗死需要細胞移植后分化的細胞種類更多,但是腦梗死是一次性的腦組織缺血損傷而非退行性改變，已經缺血壞死的腦組織不會再持續的退化，因此細胞移植治療腦梗死不需要再進行基因修飾和重新編碼。Jiang等[9]在小鼠模型上初步完成了iPSC治療腦梗死的實驗，以評估治療的效果及風險，雖然移植后小鼠的功能得到了改善，但發現大量的iPSC細胞經移植后死亡，只有少量細胞存活，且存在高致瘤性的問題。有報道稱經顱內直接注射細胞較硬膜下腔注射的方法導致畸胎瘤的概率增高。有研究將纖維蛋白膠與iPSC混合后移植入腦梗死小鼠的硬膜下腔，觀察到小鼠的功能改善，梗死面積縮小，且在6周后未發現腫瘤的形成，說明纖維蛋白膠可以一定程度上降低腫瘤發生的概率[10]。

由于iPSC的較高致瘤性和較低存活率，將未分化的iPSC直接用于治療腦梗死是不可行的，而移植后的iPSC需要先分化為神經干細胞(neural stem cells NSC)，才能進一步分化成為神經元和神經膠質細胞，生理條件下人的腦組織側腦室的腦室下層及海馬齒狀回粒內含有一定量的神經干細胞，這些細胞以膠質細胞的狀態存在而不發揮功能，當神經細胞受到損傷時這些神經干細胞受到環境因素中某些信號因子的影響遷移、分化為神經元而發揮功能。移植的NSC具有弱免疫原性的特點，進行細胞移植后很少發生免疫排斥的現象。此外，NSC的趨化性較強，由于微環境的作用，移植入體內后可向病灶處遷移、增殖、分化。因此，有研究將iPSC-NSC移植應用于治療腦梗死[11]，目前已有多種方法可在體外成功地將iPSCs誘導為神經干細胞[12-14]。有研究將人類iPSC-NSC移植到腦缺血大鼠的紋狀體，并使用MRI追蹤發現細胞經注射區域沿著胼胝體遷移至腦梗死區域，與宿主細胞發生整合，取代受損的細胞重建神經環路[15]。此外，神經干細胞修復神經系統的損傷可能還有以下機制：(1)NSC分化為多種類型的成熟神經元、星狀細胞、少突膠質細胞，修復、替代梗死后缺損的神經細胞；(2)改變微環境，產生營養因子，如成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor)、表皮生長因子(epidermal growth factor)、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor)等促進損傷修復作用的營養因子[16]；(3)減少了炎癥反應的發生、抑制了膠質細胞的增生，且促進了室管膜下區內源性神經干細胞的增殖和遷移，整體提高了神經細胞的修復能力；(4)通過促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor)和促血管生成素的生成，從而促進新生血管的形成，為神經功能的恢復提供充足的血供[17]。實驗證據表明無腫瘤細胞形成。Oki等[8]人將在體外獲得的iPSC-NSC移植到腦梗死小鼠模型的紋狀體，10周后發現移植的細胞存活率是10%。Oki等人在10只裸鼠身上再次重復這個試驗，48 h后進行神經干細胞的移植，4個月后發現細胞的存活率為50%，免疫熒光檢測發現72%的細胞表達成熟神經元抗體，6%的細胞表達星形膠質細胞的抗體，2個月后2只小鼠死亡，8只存活，4個月后4只小鼠死亡，6只存活，所以移植后2個月的存活率為80%，4個月為60%；4個月后77%的細胞表達成熟神經元抗體，5%的細胞表達紋狀體細胞的標志物—多巴胺能和cAMP相關的神經元磷蛋白(DARPP)-32，這個百分比與細胞直接移植到紋狀體后，存活的機率大致相同。這一發現預示著進行移植的部位(例如皮層、紋狀體)不影響細胞最終的存活，而在體外將iPSCs分化為神經干細胞再進行移植比直接使用iPSCs更能提高細胞的存活率。

目前iPSC的應用存在最大的問題就是在基因整合的過程中腫瘤的發生，目前導致iPSC成瘤的因素還未明確。Riggs等[18]發現iPSCs與惡性肉瘤有部分細胞類型相同，在沉默基因與代謝活性方面存在某些共性，認為iPSC與癌細胞十分相似，腫瘤發生的原因可能就在于此。Park等[19]認為使用病毒作為載體將體細胞轉化為干細胞過程中會產生基因突變，導致腫瘤的發生。Mohammad等[20]用無病毒載體和無外源基因的編程方法誘導出iPSC，再將這些細胞分化成為神經干細胞，并將這些細胞移植到腦梗死發生7 d后的實驗小鼠體內，通過移除黏附物能力測試，測試到小鼠恢復了感知功能，且腦源性神經營養因子也相應的增加，從而促進細胞的存活、生長及突觸的形成，12個月后測試無腫瘤形成。為了去除iPSC中的致腫瘤基因，Liu等[21]也使用相同的方法在缺氧的條件下僅使用2個因子將小鼠成纖維細胞轉染為iPSC，并將其誘導為神經干細胞注入腦缺血小鼠模型，小鼠的神經功能缺損也得到了改善，且無腫瘤形成。Thier等[22]使用最新的技術，成功地激活了Oct4將小鼠成纖維細胞轉化為iPSC，這種方法與傳統的iPSC技術相比生產速度提高了2～3倍，且細胞的致瘤性也得到了降低。有實驗表明當移植宿主存在免疫缺陷時會增加致瘤的風險[23]。

由于腦梗死的發病年齡老年化，因此Tatarishvili等[24]在24個月齡的大鼠身上完成了細胞移植治療腦梗死的實驗，發現在神經干細胞移植8周后49%的細胞分化為成熟的γ氨基丁酸神經元，圓筒實驗證明小鼠缺損的神經功能明顯得到改善，且減少了小膠質細胞的激活。目前大多數已發表的實驗都使用的是健康雄性鼠，將來還需要在雌性鼠及一些合并其他疾病的鼠身上開展實驗，如高血壓病、糖尿病等，這些都是腦梗死的危險因素[22]。

2 移植的時間窗和劑量

iPSC-NSC移植的重要問題之一就是腦梗死發生后細胞移植的時間，以往胚胎細胞移植的經驗提示大腦中動脈閉塞致腦梗死發生后在第48 h移植細胞的存活率最高[25]，Shear等[26]認為腦梗死發生后第2～7 d為神經干細胞移植的最佳時間，而非在這個時間點之前移植可能與急性期局部腦組織壞死、細胞釋放的炎癥介質增高有關，且急性期的神經營養因子較少，不利于細胞的生長，但是在腦梗死發生后第48 h這一時間點移植在臨床實施上比較困難，制備一定量的iPSC至少需要4周，再將其誘導為需要的神經干細胞又需要幾周，而將這些細胞應用于臨床前還需要經過一系列的實驗，確保其安全性。因此，以現在的制備技術達到時間窗的要求還十分的困難。

目前就腦梗死細胞移植劑量的數據統計還十分匱乏，大部分的數據主要來自鼠胚胎神經干細胞的實驗，Darsila等[27]分別將3×105、7.5×105和15×105數量的神經干細胞移植到腦梗死小鼠模型的腦內，結果顯示當移植細胞數超過3×105的時候，細胞的存活率將不再隨著細胞數的增加而增加，提示3×105數量的神經干細胞可以以最小的數目發揮較好的治療效果。Wang等[28]認為8×105數量的神經干細胞治療腦梗死的Wistar大鼠為最佳數目。此項實驗還沒有在與人類腦體積和構造相似的大型動物身上實踐過，所以應用人體的細胞數量可否依據這些實驗的細胞數據成比例計算還不明確。

3 展 望

目前對iPSC的定向誘導和神經干細胞的移植治療腦梗死實驗研究已有很多，但還都停留在探索階段，以iPSC為基礎的細胞療法在治療腦梗死方面存在著巨大的潛力，但還有很多問題亟待明確，如iPSC的致瘤性、神經干細胞移植的數量、時間、部位(缺血半暗帶內還是梗死區域)。為了保證iPSC和NSC的質量和減少制備時間，將來需要建立統一來源的iPSC細胞儲備庫，提供優質來源細胞，增加移植后的安全系數，使細胞移植治療腦梗死應用于臨床早日實現。

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