Profilin在弓形蟲侵入宿主細胞及誘導免疫應答中作用的研究進展

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剛地弓形蟲是寄生于人和高等動物有核細胞的一種頂復門寄生蟲，呈世界性分布，感染了世界近1/3的人口，我國感染率為5%～20%且無性別差異[1]。弓形蟲可通過母嬰垂直傳播導致流產、胎兒畸形、死胎、智力低下等，也可以穿透血眼屏障、血腦屏障、血睪屏障導致視網膜脈絡膜炎、癲癇、雄性生殖障礙等疾患。弓形蟲是專性細胞內寄生原蟲，通過對宿主細胞的黏附、侵入并在細胞內形成納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)進行繁殖，同時借此可逃避宿主免疫識別造成潛伏感染，當機體免疫低下時則會表現明顯癥狀。弓形蟲profiin (TgPRF) 作為肌動蛋白結合蛋白可與肌動蛋白單體(G-actin)形成二聚體調節肌動蛋白的聚合，是蟲體滑行侵襲細胞、逸出宿主細胞以及毒力的必需因子，TgPRF缺乏時可引起弓形蟲侵入宿主細胞障礙[2]。同時，TgPRF通過TLR-Myd 88途徑在激活宿主固有免疫應答中起關鍵作用，誘導或調節DC、NK、巨噬細胞(MФ)分泌IL-12、IFN-γ等，并通過抗原呈遞進一步參與適應性免疫的激活[3-5]。本文將對TgPRF的分子結構特點及其在調控弓形蟲侵入宿主細胞、誘導宿主免疫應答機制的研究進展進行闡述。

1 TgPRF的結構特征

profilin是參與調節肌動蛋白聚合的一種小分子蛋白，結構高度保守，存在于所有的真核生物。TgPRF(AAX33672)是弓形蟲最重要的肌動蛋白結合蛋白之一，由163個氨基酸組成，分子量為17.5 kD，等電點為4.40，酸性氨基酸總數(Asp+Glu)共為30個，堿性氨基酸總數(Arg+Lvs)共為15個。TgPRF共形成9個β折疊，4個α螺旋，其中53個氨基酸可能形成無規卷曲連接[6-7](圖1A)。之后進一步通過分子排阻色譜和多角度激光散射分析，如同多數profilin蛋白，TgPRF分子結構一面的N端和C端各有一個α螺旋，另一面也有2個α螺旋，它們之間夾有七股β折疊，這些β折疊與非頂復門寄生蟲profilin相似，但其β股6、7延長，是非頂復門寄生蟲profilin的近2倍并形成溶劑暴露界面，易被溶劑分子接觸。TgPRF與非頂復門寄生蟲profilin的顯著不同區域主要集中在β股2和α螺旋3之間的31個氨基酸(37-68殘基)，TgPRF在這個區域有一個強酸性環(DDDD序列)，α螺旋2和一個突出的β發夾(50-67殘基)(圖1B)，這些結構在頂復門較為保守，但TgPRF的這些結構序列與頂復門其他原蟲也有所不同[7]。此外，有學者采用TMHMM、Bcepred、Gene Runner等程序分析顯示TgPRF蛋白不存在跨膜結構；有5個親水性區域，這些氨基酸殘基傾向于暴露在蛋白表面并易被特異性抗體識別；其T/B細胞聯合抗原表位為1～22、66～80和150～160位氨基酸[6]。由上可見，TgPRF有其獨特的酸性環序列、β發夾結構，并推測有大量的活性表位，其在蟲體生活周期和免疫應答中可能發揮重要作用。

A: 示TgPRF序列及二級結構，共163個氨基酸形成9個β折疊，4個α螺旋，藍色框示酸性環序列，紅色框示β發夾序列。B：示TgPRF三級結構，藍色部分示特異結構—酸性環，α螺旋2及β發夾。A: The TgPRF sequence and the secondary structure, 163 amino acids form nine β fold, four α helix, blue frame shows acid ring sequence, the red box shows β hairpin sequence. B: The TgPRF tertiary structure,the blue parts shows specific structures—acid ring, α helix 2 and β hairpin.圖1 TgPRF序列及結構Fig.1 Sequence and structure of TgPRF

2 TgPRF在弓形蟲入侵宿主中作用

弓形蟲由于缺乏鞭毛或偽足運動細胞器，其借助一種獨特的滑行運動(gliding motility)侵入宿主細胞。這種滑行運動由肌動蛋白-肌球蛋白為核心的分子馬達(actin-myosin motor)驅動。弓形蟲入侵宿主過程主要包括黏附、侵入并在宿主細胞內形成納蟲空泡(PV)。Sibley等研究證實弓形蟲速殖子頂端微線體分泌大量微線體蛋白(MIC) 使其粘附于宿主細胞膜，與棒狀體分泌的頸部蛋白(RONs)一同于蟲體前端與宿主細胞之間形成環形連接區域，之后依靠肌動蛋白-肌球蛋白馬達迅速擠過連接區域，進入宿主細胞[8]。用細胞松弛素或促微絲聚合劑預處理弓形蟲后，均可抑制速殖子的滑行運動和對宿主細胞的入侵，表明弓形蟲侵入宿主細胞、跨越生物屏障和蟲體逸出細胞依賴于肌動蛋白正常聚合和解聚[9]，TgPRF在維持這種動態平衡及介導細胞運動中發揮重要作用。

Profilin存在于所有的真核生物并在肌動蛋白聚合的調節中扮演多重角色。最初研究顯示profilin可隔離G-actin引起微絲解聚，后來發現profilin還通過增強核苷酸的轉換由ADP-G-actin到ATP-G-actin，形成profilin-ATP-G-actin二聚體并可結合Formin同源結構域1(FH1)，同時formin-FH2又結合微絲刺端(barbed ends)，以此促進肌動蛋白單體聚合到微絲上[10]。目前，關于TgPRF在弓形蟲肌動蛋白調節中作用尚存爭議。一種觀點認為TgPRF符合上述profilin的經典作用模式。Yarovinsky等通過pull-down實驗發現 TgPRF能有效結合弓形蟲肌動蛋白，形成TgPRF-G-actin復合體。重組TgPRF進行體外實驗，發現其可大量聚合在游離的刺端并促進微絲組裝。進一步生化分析發現，當刺端被凝溶膠蛋白加帽時微絲停止聚合，而同時TgPRF在尖端(pointed ends)通過隔離G-actin引起微絲解聚。因此，在微絲未加帽時TgPRF可通過促進刺端聚合和尖端解聚作用而維持微絲的動態穩定[2]。與上述觀點不同，Skillman等發現TgPRF可微弱地抑制ADP-actin到ATP-actin轉換[11]，這與Kucera的結果一致[7]。同時，弓形蟲formin FH1基序(motif)退化，含有較少的脯氨酸，導致其體外與TgPRF結合力較弱無法與formin免疫共沉淀[7,12]。基于以上研究，進一步通過體外聚合實驗，發現在弓形蟲肌動蛋白中加入等摩爾濃度的TgPRF后反而抑制formin誘導的肌動蛋白聚合，提示 TgPRF主要作用是隔離肌動蛋白而不參與微絲的組裝[11]。由于弓形蟲速殖子在靜止和侵襲階段可能存在肌動蛋白動力學、formins表達或調控的差異，TgPRF與G-actin結合后亦可能導致構象改變而與formin FH1結合，尚有其他蛋白參與肌動蛋白調控。因此，上述實驗結果并不能準確反映蟲體內部TgPRF的調控機制。盡管如此，利用四環素誘導系統消除弓形蟲TgPRF表達后導致蟲體滑行運動、入侵障礙；人工增加細胞內Ca2+水平可刺激弓形蟲從細胞逸出，當去除TgPRF后逸出機制失效，用TgPRF-/-蟲體感染小鼠存活率達到100%[2]。綜上表明，雖然TgPRF在調控蟲體運動中的確切機制還不明確，但其作為維持蟲體內G-actin池含量的關鍵因子，在維持微絲正常組裝中發揮十分重要的作用，是弓形蟲滑行運動、入侵宿主細胞和逸出必不可少的關鍵蛋白。

3 TgPRF在誘導宿主免疫應答中的作用

弓形蟲感染可引發宿主固有免疫與適應性免疫，激活多種免疫細胞，如樹突狀細胞(DCs)、巨噬細胞、淋巴細胞、NK細胞等，它們之間相互協同，分泌多種細胞因子抵抗弓形蟲感染，尤其是Th1型細胞因子(IFN-γ，IL-12等)。固有免疫主要由病原相關分子模式(PAMP)與模式識別受體(PRR)結合激活。Toll樣受體(TLRs)為主要的PRR成員，DCs即通過TLR-Myd88-NFκB通路在宿主識別弓形蟲抗原、激活固有免疫中起關鍵作用[3]。Yarovinsky等報道，超聲裂解并高速離心后獲得弓形蟲速殖子可溶性抗原(STAg)能刺激DCs分泌IL-12，同時生化分析證實STAg中的一個相對分子質量為17.5 kD小分子肌動蛋白結合蛋白，即TgPRF在此應答中起主要作用[4]。為研究TgPRF在完整蟲體激活宿主免疫應答中的作用，Plattner等通過四環素誘導系統消除蟲體TgPRF表達后，發現其完全喪失誘導DCs產生IL-12的能力[2]。用惡性瘧原蟲profilin相關基因替換TgPRF后，完全恢復弓形蟲的侵襲和感染，但依然不能有效刺激體外培養的DCs或小鼠產生IL-12；相反，若細胞松弛素D處理后，弓形蟲侵入細胞能力喪失，但DCs產生IL-12/23p40幾乎不受影響[7,13]，表明IL-12產生是由于蟲體TgPRF的誘導而與入侵細胞無關。用TgPRF分別刺激TLR11 -/- 和MyD88-/-小鼠脾DCs均未能產生IL-12p40[4,15]，IL-12可使機體免疫轉向Th1極化、誘導NK細胞分泌IFN-γ，在急性及慢性感染中缺乏IFN-γ會加速蟲體復制和感染動物死亡，提示TgPRF是抵抗弓形蟲感染關鍵的抗原分子。由上可見，TgPRF可通過DCs的TLR11-MyD88 信號通路激活固有免疫，介導高水平IL-12、IFN-γ的產生。此外，隨著對TgPRF結構的研究，發現其酸性環和β發夾是識別TLR11關鍵結構，將這些特有序列插入酵母菌profilin中足以激活TLR11信號[7]。TgPRF啟動固有免疫的同時也激活適應性免疫應答。例如，采用STAg反復免疫小鼠后可誘導強大的特異性CD4+T細胞反應，提取小鼠CD4+T細胞，加入脾細胞作為抗原提呈細胞(APC)，用STAg和TgPRF刺激后產生等程度的回憶增殖反應，表明TgPRF是CD4+T細胞應答的一個優勢抗原[4]。進一步用TLR11 -/-小鼠進行了類似上述的實驗，發現TgPRF的回憶反應顯著減弱、表達CD44的活化CD4+T細胞明顯降低，同時，MyD88 -/-小鼠也未呈現對 TgPRF的回憶刺激反應。使用熒光標記的TgPRF，測定TLR11和MyD88在DC抗原攝取中的調控作用，野生型小鼠DCs細胞群含有的熒光標記細胞是任一缺陷小鼠(TLR11-/-或MyD88-/-)的5倍，表明DCs亦可作為APC以TLR11-MyD88依賴方式處理和呈遞TgPRF[15-16]。Hieny等利用STAg反復免疫H2-Ab1-/-(MHC II類缺陷)和Myd88-/-的小鼠，提取CD4+T細胞后再用TgPRF刺激并進行細胞內IFN-γ染色，顯示IFN-γ+CD4+T細胞減少[15]，亦導致小鼠iNOS誘導嚴重延遲[16]，說明TgPRF特異性免疫原性取決MyD88和MHC II類分子的雙表達。其他學者也證實TgPRF在DCs的遞呈需TLR11信號通路和MHC II類分子順式識別作用[3]。總之，TgPRF通過DCs為介導不僅引起細胞因子的分泌，也提供了輔助性T細胞分化的重要信號，在促進Th1極化抗弓形蟲感染中起重要作用。

4 TgPRF相關TLRs

TLR11是一種細胞內受體，將Alexa Fluor 488標記的TgPRF與原代DCs短時共培養，顯示TgPRF在細胞內迅速積累且與TLR11共同定位，并且TLR11與其他胞內TLR(如TLR379)一樣也依賴內質網駐留蛋白UNC-93B1[13]。由于TLR11和細胞內受體TLR12序列具有高度的同源性，因此TLR12與TLR11一樣，也可識別TgPRF[17]。用ME-49蟲株分別感染TLR11-/-、TLR12-/-小鼠，發現TLR12-/-小鼠更易死亡，TLR12-/-巨噬細胞受TgPRF刺激時IL-12p40水平顯著降低，表明TLR12同樣在TgPRF識別中發揮重要作用。Raetz等還發現，TLR11和TLR12能夠形成異源二聚體，但只有TLR11能夠招募MyD88形成復合體觸發級聯信號[18-19]。通過比較TgPRF免疫TLR11-/-、TLR12-/-、TLR11-/-TLR12-/-小鼠NK細胞產生IFN-γ的水平，發現TLR11-/-組IFN-γ水平下降，但是其他兩組幾乎未見IFN-γ產生[18]。以上實驗表明TgPRF完全發揮免疫效應需要TLR12和TLR11的協同作用，任一個受損均弱化或者喪失其誘導IL-12及IFN-γ效應。然而，人類細胞不表達TLR11和TLR12，但一些研究已經證實了鼠體內TLR5和TLR11功能的重疊，TLR11的配體尿道致病性大腸桿菌(UPEC)同樣對TLR5產生應答，反之亦然[20]。TLR5識別細菌鞭毛蛋白高度保守的表面序列[21]，該序列包括一個類似于TgPRF長度的β-發夾結構[22]。Salazar Gonzalez等用TgPRF刺激分離的人外周血單核細胞產生大量IL-12，同樣條件下用TLR5單克隆抗體預處理或siRNA技術抑制TLR5基因的表達，均導致TgPRF誘導的IL-12顯著減少，提示TgPRF可通過TLR5啟動人體免疫應答[23]。但最近有研究結果并不支持上述觀點，其用TgPRF刺激人單核細胞未能產生細胞因子[24]。因此，TgPRF在人體如何誘導免疫應答仍待進一步研究。

5 展 望

弓形蟲病作為人獸共患病，在家畜及動物間傳播和流行，嚴重威脅人類健康并對畜牧業生產造成損失。弓形蟲感染機體后引起的免疫調節較為復雜，其中TgPRF是蟲體入侵宿主必不可少的關鍵蛋白，同時通過TLR-MyD88 信號通路激活宿主固有免疫與適應性免疫，從而增強宿主對弓形蟲的抵抗。TgPRF與艾美球蟲profilin高度同源，用艾美球蟲的profilin作為佐劑與弓形蟲抗原經腹腔或鼻內途徑免疫小鼠，可增強宿主免疫應答[25]。有學者在自體腫瘤細胞疫苗中加入純化的TgPRF作為免疫佐劑接種小鼠，發現TgPRF增強骨髓巨噬細胞(BMMs)抗原呈遞能力和共刺激分子表達，并通過MyD88信號誘導IL-12和趨化因子(如CCL5，CCL12)產生，進而增加巨噬細胞吞噬腫瘤細胞能力并促進免疫細胞遷移到腫瘤部位[26]。可見，TgPRF可作為免疫佐劑在疾病防治中有廣泛的應用前景。Tanaka 等將純化TgPRF經脂質體包裹后皮下免疫小鼠，發現可誘導機體特異免疫應答，弓形蟲感染小鼠的存活率增加并降低腦內包囊數[27]。綜上，TgPRF即可作為疫苗備選蛋白又可作為基于TLR的疫苗佐劑誘導及增強機體免疫應答，進一步研究TgPRF在弓形蟲入侵及激活宿主免疫中作用，將有助于為預防和治療弓形蟲感染提供新靶點，也為開發安全、有效的亞單位疫苗提供依據。

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