江西省漢灘型漢坦病毒分離株AYW89-15全基因組序列分析

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漢坦病毒HV(hantavirus)為布尼亞病毒科漢坦病毒屬分節段的負鏈RNA病毒，其基因組分為大(L)、中(M)、小(S)3個基因片段，分別編碼RNA 依賴的 RNA 聚合酶，糖蛋白前體(GPC蛋白)，核蛋白(N蛋白)[1]。HV目前有41個型別(基因型/血清型)，不同基因型的HV又可分很多基因亞型，新的基因型或基因亞型的漢坦病毒不斷被發現使得HV的進化和發生比預期更復雜[2-3]。HTNV是漢坦病毒的代表基因型，因其引起臨床癥狀重、死亡率高的腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)而被廣泛關注。在我國，HTNV分為9個基因亞型[4]，宿主動物是以黑線姬鼠為代表的室外鼠。在前期研究中我們發現江西省可能存在新亞型的HTNV[5-6]，為了能明確江西省的HTNV基因特征和基因亞型，本研究對分離到的1株HTNV進行了全基因組測序，結果報告如下：

1 材料和方法

1.1標本來源 AYW89-15株為本實驗室采用Vero-E6細胞從江西省安義縣黑線姬鼠中分離的。

1.2主要試劑 QIAcube HT 核酸提取試劑盒(Qiagen)、One-Step RT-PCR 試劑盒(Qiagen)。

1.3引物設計與合成 毒株全S、M、L 基因分別分1、3、6段擴增，根據GenBank中76-118株和Z10株基因序列，應用Primer Primer5.0設計并由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 HTNV全基因組分段RT-PCR擴增引物
Tab.1 RT-PCR primers for amplifying the complete genen of HTNV

基因片段segement引物名稱Primername5'-3'位置location目的片段大小/bplengthSSFTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA1～211699SRTAGTAGTAGTATGCTCCCTAA1698～1678MM1FTAGTAGTAGACTCCGCAAAAGA1～221198M1RCCCAGGACCAGATAAGACAC1198～1179M2FTGGGCTATTCCCTCAGTT1060～10771028M2RGAGCTGGAAGTCAGGGAG2088～2070M3FATCCTCTGGGCTGCAAGTG1964～19831653M3RCTAGTGTACATCCAGCATCCTT3616～3595LL1FTAGTAGTAGACTCCCTAAGTGACAA1～251324L1RGAGTTGATGGCTCAGTTATGTTC1324～1346L2FACATCATACAAACCTGCCACA939～9591622L2RACCATCCTCCTGGACTTGC2560～2542LF3ACGGCTATATGATGTGGGAGCTTCG2334～23581340LR3ACATCGGCTCTGTGCTGCTGC3673～3653L4FATGGGACTGACTGGTTCTTATTTG3372～33951296L4RAACTCCGTCTTTCATTGTCTTTAGG4667～4643L5FATAAGTTTGCTGTGACCGTGGAT4563～45851004L5RTTGCACGTAGTCCATCATCCTTTAC5567～5543L6FTGATGGATGAGGTTTCAAAGGAG5334～53561300L6RTAGTAGTAGTACGCTCCGGAAAAT6533～6510

1.4核酸擴增和測序 采用全自動核酸提取儀(Qiagen)和QIAcube HT 核酸提取試劑盒進行核酸提取。采用One-Step RT-PCR試劑進行擴增，RT反應：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；PCR循環如下：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 45 s，共擴增35個循環，72 ℃延伸 10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，目的片段擴增產物送上海生物工程有限公司進行TA克隆，挑取每個目的產物的3個陽性克隆子進行測序。

1.5對測序結果進行分析并構建系統發生樹 運用DNAStar 軟件(SeqMan)對測定的序列進行拼接，運用MEGA6.0軟件對核苷酸和氨基酸進行比對分析，以鄰位相連法((neighbor-Joining，NJ))構建系統發生樹。

2 結 果

2.1全基因擴增 S、M、L基因擴增電泳結果見圖1。一條S目的片段大小1 698 kb； M片段分3段擴增(圖1B)，目的片段大小分別為1 198 bp、1 023 bp、1 653 bp；L片段分6段擴增，目的產物為1.0 kb ～1.6 kb。擴增產物電泳圖與預期結果相符。

M：DL2000Marker; 1: S基因；2～4：M基因M1～M3；5～10：L基因L1～L6 M：DL2000 Marker; 1: S segment； 2～4：M segment M1～M3；5～10：Lsegment L1～L6 圖1 AYW89-15毒株RT-PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis patterns of RT-PCR products of AYW89-15

2.2全基因組序列分析 經克隆、測序、序列拼接和分析，AYW89-15株全基因組共有11 848個核苷酸，其中S、M、L基因分別含1 699、3 616、6 533個核苷酸，分別編碼429、1 135、2 151個氨基酸。S、M、L基因序列均上傳至GenBank，登錄號分別為：KY978755、KY978756、KY978757。

S基因4種堿基的比例分別為31.19% A、25.78% T、19.60% C、23.43%G。S基因編碼區為37 nt～1 326 nt，5′端、3′末端分別含36個和373個核苷酸的非編碼區。

M基因4種堿基的比例分別為30.53% A、29.37% T、18.42% C、21.68%G。M基因編碼區為41 nt～3 448 nt，5′端、3′末端分別含40個和168個核苷酸的非編碼區。

L基因4種堿基的比例分別為33.19% A、29.17% T、16.72% C、20.92%G。L基因編碼區為38 nt～6 493 nt，5′端、3′末端分別含37個和40個核苷酸的非編碼區。

參考株名稱后括號內為相應的毒株基因的GenBank登錄號，SEOV：80-39株GenBank accession number of each reference strain is in the bracket behind the strain`s name; SEOV：80-39 strain圖2 AYW89-15 株S基因核苷酸系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of AYW89-15 based on the complete S segment

參考株名稱后括號內為相應的毒株基因的GenBank登錄號，SEOV：80-39株GenBank accession number of each reference strain is in the bracket behind the strain`s name; SEOV：80-39 strain圖3 AYW89-15 株 M基因核苷酸系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of AYW89-15 based on the complete M segment

參考株名稱后括號內為相應的毒株基因的GenBank登錄號，SEOV：80-39株GenBank accession number of each reference strain is in the bracket behind the strain`s name; SEOV：80-39 strain圖4 AYW89-15株 L基因核苷酸系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AYW89-15 based on thecomplete L segment

2.3全基因組序列核苷酸系統進化分析，核苷酸和推導氨基酸同源性分析 采用MEGA6.0軟件對核苷酸和氨基酸進行比對分析，以NJ法構建系統發生樹。S、M、L3個基因的核苷酸系統進化分析分別見圖2、圖3、圖4。AYW89-15的3個基因在系統進化樹中都分布在HTNV型并且獨立分支。M基因進化樹分亞型結果(圖3)顯示，AYW89-15不在HTNV的9個亞型中，獨立分支。AYW89-15 株S基因與HTNV標準株76-118株核苷酸同源性87.3%，氨基酸同源性96.7%，與GenBank中21株HTNV比較核苷酸同源性為83.4%～87.3%，氨基酸同源性為96.5%～98.4%，與漢城型漢坦病毒(Seoul virus, SEOV)核苷酸同源性71.8%，氨基酸同源性82.3%，S基因有一個氨基酸位點發生了變化(Ile75Leu)。

M基因與HTNV標準株76-118株核苷酸同源性84.7%，氨基酸同源性96.5%，與GenBank中25株HTNV核苷酸同源性為79.7%～84.7%，氨基酸同源性為92.3%～96.5%，M基因有6個氨基酸位點發生了變化，分別是： Trp 4 Leu、Tyr43His, Asp262Glu、Ile337Val、His348 Tyr、Val664 Ile。AYW89-15M基因存在6個潛在的天門冬酰氨糖基化位點分別為(第N134、235、347、399、609、928位)，與76-118株相比缺少了一個第N766位的糖基化位點。

L基因與HTNV標準株76-118株核苷酸同源性83.6%，氨基酸同源性97.1%，與GenBank中12株HTNV核苷酸同源性為80.5%～84.1%，氨基酸同源性為95.8%～97.5%。

3 討 論

過去10年全國共報告HFRS病例112 177例，死亡病例1 116例[7]。 江西省于1961年報告首例HFRS病例，至今每年都有HFRS病例報告，2005-2013年HFRS病例報告數位居全國前10位(共30個省市自治區報告病例)[8]。流行病學和分子生物學研究都表明江西省為HTNV和SEOV的混合疫區。關于江西省SEOV分離株的研究有相關的報道，全片段基因分析提示，該型病毒基因變異較小[9]；然而，對來源于鼠肺標本的HV部分基因研究顯示江西地區HTNV與國內外其他HTNV差異較大，推測可能為新亞型的HTNV[6]。目前尚未有江西省HTNV的病毒分離株全片段基因組序列信息的報道。為了更全面的了解江西HTNV的基因特征和基因亞型，本研究對HTNV分離株AYW89-15株進行了全基因測序分析。

國際病毒分類委員會(ICTV)對基因分型的建議：確定一個型別，基因序列上N蛋白和GPC蛋白氨基酸序列與其他HV氨基酸序列比較至少有7%不同[10]。 確定一個亞型，在其一個基因片段中至少應有5%～24%的核苷酸序列不同；確定為同一亞型，在所有3個基因片段的核苷酸序列差異應小于4%[11]?；蚍中偷臉藴手饕且罁《竞塑账嵝蛄袠嫿ǖ南到y發生樹中的位置來確定。依據核苷酸序列以NJ法或最大簡約法(maximum parsimony，MP)構建系統發生樹是目前HV基因分型或研究病毒間發生關系最常用的方法。張永振等[12]認為漢坦病毒的基因分型及系統發生分析時，NJ 法優于 MP法，用M片斷的Gl核苷酸序列可以替代M與S片斷全序列進行基因分型及系統發生分析。2002年王世文等[4]采用分子生物學方法對HV部分M基因測序和系統發生分析HTNV分為9個亞型。隨著分子生物學發展，不斷有新的基因型和新基因亞型HV的報道。Xu等[13]對我國蝙蝠中的HV全基因組序列分析發現新基因型的HV。Li等[14]通過對湖北分離的HV004株進行全基因組測序和系統進化分析發現，HV004株與國內外HTNV核苷酸和氨基酸差異同源性為83%～90%，氨基酸同源性95%～99%，HV004株在基因進化樹上獨立分支，確定HV004株為HTNV新的基因亞型。本研究AYW89-15株的全基因與國內外HTNV比較，核苷酸序列同源性為79.7%～87.3%，氨基酸序列同源性為92.3%～98.4%。與其他HTNV相比AYW89-15核苷酸和氨基酸差異度均大于HV004株。以NJ法構建系統進化樹表明AYW89-15分布在HTNV分支，但是3個基因在系統進化樹上均獨立分支?；谌玀片段進化樹分亞型結果顯示AYW89-15不在現有HTNV的9個亞型中。因此，我們認為AYW89-15株為HTNV新的基因亞型，江西省存在新基因亞型的HTNV。

N蛋白是漢坦病毒的主要抗原蛋白，N蛋白的氨基末端在漢坦病毒感染體液免疫反應中起著重要的作用，引起體液免疫反應的抗原域被認為是位于氨基末端[15]。糖蛋白前體經切割為G1和G2糖蛋白，可誘導中和抗體。在G1和G2區的糖基化位點對蛋白質折疊、細胞內運輸及細胞融合非常重要[13]。與其他HTNV相比，AYW89-15 N蛋白第75位氨基酸發生了變化。AYW89-15株 G1、G2區保守的6個糖基化位點和其他HTNV相同，與76-118株相比，因第768位氨基酸發生變異導致缺少N766位的糖基化位點。整個GPC蛋白氨基酸存在6個氨基酸變異。N蛋白和GPC蛋白氨基酸位點的變異對AYW89-15株生物學特征的影響還需進一步研究。

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