牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的研制與評價

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牛結核病(bovine tuberculosis)是一種主要由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，在我國被列為二類動物疫病，世界動物衛生組織(OIE)將其列為需通報的動物疫病[1]。該病一年四季均可發生，具有世界流行性。牛分枝桿菌不僅會引起牛自身生產力的下降，而且對人類健康也構成了嚴重的威脅[2]。

目前，發達國家常采用比較變態反應和牛結核γ-干擾素體外釋放試驗進行檢疫[3]，如歐美等發達國家常采用比較變態反應試驗作為檢疫依據，以其強大的經濟實力為支撐，撲殺結核陽性牛，從而控制和消滅牛結核病。牛結核γ-干擾素體外釋放試驗已在多國應用，評價較好，澳大利亞、加拿大等國的臨床應用表明，該方法既能保證靈敏度，又能極大地提高檢測的特異性[4]。

目前國內主要是通過單純頸部皮試變態反應(TST)來進行牛結核病的檢疫[5]，該方法價格低廉，但工作量大、所需時間長。此外，采用現行國標GB/T 18645-2000執行皮內變態反應進行牛結核病檢疫時，不同的提純結核菌素(PPD)批號、注射劑量等因素都會導致個體差異較大[6]，且其結果以皮膚厚度的增加數為評判標準，易造成主觀誤差，不適合牛結核病診斷[7-8]。牛結核γ-干擾素體外釋放試驗(國標GB/T 32945-2016)可以作為TST的理想補充試驗[9-10]，但由于商品化BOVIGAMTM試劑盒價格昂貴，限制了其在我國的推廣應用。近年來，國內雖有不少學者建立了牛γ-干擾素ELISA檢測方法，但其檢測方法僅局限于實驗室，至今未有商品化試劑盒上市。

因此研制快速、靈敏度強、特異性高的診斷試劑盒是牛結核病檢疫中亟待解決的問題之一。本研究在牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的基礎上[11]，試制出牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒，并進行了初步臨床應用，為牛結核病的診斷提供了靈敏度高、特異性強的檢測方法和試劑。

1 材料與方法

1.1刺激劑與試劑盒 皮膚試驗用牛型純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)購自中國獸醫藥品監察所，BOVIGAMTMMycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle購自Thermo Fisher公司，牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒由江蘇省人獸共患病學重點實驗室試制，批次分別為S2013001，S2013002，S2013003。

1.2試驗用牛 中國東部地區14個奶牛群，隨機抽取健康奶牛和結核病疑似陽性奶牛，共計961頭活畜。

1.3牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的建立

1.3.1包被抗體與檢測抗體使用量的確定 參照文獻[11]以含天然BoIFN-γ的陽性血漿和未刺激的陰性血漿作為樣品，純化單抗2G5采用1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 4個濃度梯度，HRP-5E11的稀釋度分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000。通過采用正交方陣實驗，進行最佳包被抗體和檢測抗體使用濃度的摸索。

1.3.2判定標準 具體操作參照試劑盒說明書進行，通過受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，簡稱ROC曲線)和標本與陰性對照比值法確定試劑盒的判定標準(cut-off值)均約等于0.1。因此確定結果判定標準為：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判為陽性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值<0.1或牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值<0.1則判為陰性。

1.4試劑盒的試制與組裝 本研究的ELISA檢測試劑盒由本實驗室試制(批號分為S2013001、S2013002和S2013003)，系用針對牛γ-干擾素的特異性單克隆抗體包被96孔酶標板，并配以陽性對照(凍干粉)、陰性對照(凍干粉)、樣品稀釋液、酶標抗體、酶標抗體稀釋液、含0.5% Tween-20的磷酸鹽洗滌液(20×)、底物顯色液及終止液組裝而成。再將封板膜和說明書放入試劑盒中，貼好外標簽和側標簽，從而完成試劑盒的組裝。

1.5 牛結核γ-干擾素ELISA試劑盒的評價

1.5.1試制試劑盒靈敏度試驗 使用10組試劑盒檢驗質控樣品對試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的靈敏度，測定試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的最低檢出量。

1.5.3試制試劑盒的保存期試驗 將試制的3個批次牛結核γ-干擾素ELISA試劑盒放置于4 ℃冰箱進行保存，分別于0、1、3、6、9、12、15個月取出，進行靈感度和特異度檢驗，以確定試制試劑盒的保存期限。

1.6 試劑盒符合率評價

1.6.1單純頸部皮試變態反應試驗 參照國家標準《動物結核病診斷技術(GB/T18645-2002)》進行，僅采用牛型PPD在奶牛頸部進行皮試變態反應試驗，劑量為2 000國際單位(IU)/頭，分別于注射前和注射后72 h測量皮膚厚度并計算皮厚差，依據國家標準判斷結果。

1.6.2商品化BOVIGAM試劑盒 使用BOVIGAMTMMycobacteriumbovisGamma Interferon Test Kit for cattle試劑盒檢測經特異性抗原刺激的牛抗凝全血的γ-干擾素進行牛結核病診斷，具體操作參照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的建立

2.1.1包被抗體與檢測抗體使用量的確定 以含天然BoIFN-γ的陽性血漿和未刺激的陰性血漿作為樣品，采用正交方陣實驗，進行最佳包被抗體和檢測抗體使用濃度的摸索。結果如表1所示，當純化單抗2G5以5 μg/mL包被，HRP-5E11以1∶1 000稀釋時，ELISA檢測的P/N值達到最大，因此確定為抗體最佳濃度。

2.1.2操作步驟的確定 使用5 μg/mL純化2G5抗體4 ℃過夜包被，100 μL/孔；洗滌4次，37 ℃孵育封閉2 h；洗滌4次，每孔中加入50 μL樣品稀釋液，分別將50 μL陽性對照、陰性對照加入到各孔中，37 ℃孵育2 h；洗滌5次，加入1∶1 000稀釋的酶標抗體HRP-5E11，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；洗滌5次，每孔中加入100 μL底物顯色液，37 ℃避光顯色10 min，在每孔中加入50 μL終止液，15 min內在酶標儀上測定OD450nm。

表1 最佳包被及檢測抗體使用濃度的確定
Tab.1 Optimal concentration of coating antibody and detecting antibody

檢測抗體稀釋度Detectinganti-bodydilution檢測樣品Sample包被抗體濃度(μg/mL)Concerationofcoatingantibody1.252.55101∶500P1.6091.991.9561.9N0.2010.1810.2390.284P/N8.0010.998.186.691∶1000P1.4511.6861.6761.67N0.0920.1050.0940.15P/N15.7716.0617.8311.131∶2000P1.0641.3941.3121.456N0.090.0990.1080.14P/N11.8214.0812.1510.401∶4000P0.6330.9150.8750.887N0.0790.0790.1020.089P/N8.0111.588.589.97

2.2牛結核γ-干擾素ELISA試劑盒的評價

2.2.1靈敏度評價 使用10組試劑盒靈敏度檢驗質控樣品，對實驗室試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒進行檢測靈敏度評價。結果如表2顯示，試制的3批牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的最低檢出量達到8.21 ng/mL，表明試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒具有較高的靈敏度，達到臨床診斷試劑盒要求。

2.2.2試劑盒批內及批間重復性評價 進行試制ELISA試劑盒的批內重復性(S2013001-1、S2013001-2和S2013001-3)試驗，結果如表3所示，陽性對照和陰性對照的變異系數分別為3.34%和7.58%，均小于10%，表明同一批次的試劑盒之間重復性良好，檢測結果準確可靠。同時，進行試制ELISA試劑盒的批間重復性(S2013001、S2013002和S2013003)試驗，結果如表3所示，陽性對照和陰性對照的變異系數分別為3.74%和8.20%，均小于10%，表明不同批次的試劑盒之間重復性良好，檢測結果準確可靠。

表2 3批牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒檢出量
Tab.2 Detection limit of three batches of kits

編號NumberBPPD組(OD)GroupBPPDγ-干擾素濃度(ng/mL)TheconcentrationofInterferongammaSP13.1200259.98SP22.8040231.77SP32.5700210.88SP42.2320180.70SP51.9050151.50SP61.7120134.27SP71.3800104.63SP81.075077.39SP90.667240.98SP100.30028.21

2.2.3試劑盒保存期評價 組裝好的試劑盒在4 ℃冰箱中放置15個月，分別于0、1、3、6、9、12、15個月取出，進行試劑盒檢測效果的評價。保存期試驗結果顯示，試劑盒在4 ℃條件下保存性能穩定，進行靈敏度檢驗和特異度檢驗，ELISA檢測OD值無明顯變化，穩定性良好，表明試制的ELISA試劑盒的保存期至少達到12個月以上。

2.3 試劑盒符合率評價

2.3.1牛結核γ-干擾素夾心ELISA試劑盒和單純頸部皮試變態反應的比較 將961頭試驗牛同時使用試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒和單純頸部皮試變態反應進行檢測。結果顯示，兩種方法的陽性一致數為18頭，陽性一致率為70.59%，陰性一致數為928頭，陰性一致率為99.20%，兩者總一致率為98.44%，結果見表4。

表3 試制ELISA試劑盒重復性試驗
Tab.3 Reproducibility of sandwish ELISA kit

重復性Reproducibility樣品Sample試劑盒(OD450nm)kits123C.V(%)批內Intra-assay陽性對照PositiveControl2.1062.1322.1891.9872.1022.0971.9872.1382.0323.34陰性對照NegativeControl0.0560.0650.0680.0680.0720.0650.0710.0730.0677.58批間Inter-assay陽性對照PositiveControl1.9051.8971.971.9872.0652.0971.8962.0432.1324.49陰性對照NegativeControl0.0580.0690.060.0680.0720.0680.0740.0730.0678.13

2.3.2牛結核γ-干擾素夾心ELISA試劑盒和商品化BOVIGAMTM試劑盒的比較 將961頭試驗牛同時使用試制牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒和商品化BOVIGAMTM試劑盒進行檢測。結果顯示，兩者之間的陽性一致數為21頭，陽性一致率為91.30%，陰性一致數為936頭，陰性一致率為99.78%，兩者總一致率為99.58%，結果見表4。

表4 試制ELISA試劑盒與兩種檢測方法的比較結果
Tab.4 Comparative result of sandwich ELISA kit and other two tests 頭

皮試變態反應試驗TST合計TotalBOVIGAMTM試劑盒BOVIGAMTMkit合計Total陽性Positive陰性Negative陽性Positive陰性Negative試制ELISA試劑盒Gamma-interferonsandwichELISAkit陽性Positive1842221122陰性Negative119289393936939合計Total2993296124937961

以皮試變態反應試驗和BOVIGAMTM試劑盒檢驗結果作為參考，以上2種方法檢測均為陽性的奶牛判定為牛結核陽性(共20頭)，兩種方法檢測均為陰性的奶牛判定為牛結核陰性(共928頭)，結果顯示試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的靈敏度達到85.00%(17/20)，特異度達到100.00%(928/928)。

3 討 論

結核病是威脅人類健康的重大疫病之一，結核病的防控一直被世界衛生組織高度重視，投入的結核病防控治療基金也在逐年上升[12]。目前，國內外檢測牛結核的方法主要包括細菌學方法、分子生物學方法和免疫學方法[13]。在免疫學檢測方法中，結核菌素皮內變態反應被廣泛使用，但其具有靈敏度和特異度不高、檢測時間較長等缺點。

1990年，Wood等[14]建立了通過檢測牛PPD刺激牛全血釋放的γ-干擾素，從而診斷牛結核病的ELISA方法。國內雖有不少學者建立了牛γ-干擾素ELISA檢測方法[15-16]，但至今未有成型的商品化試劑盒上市，所以國內牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的發展，與研制具有自主知識產權的牛結核γ-干擾素檢測試劑盒是必然趨勢。

本實驗室建立了牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法，在此基礎上試制了3批試劑盒，并對其進行了評價。試制的3批牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒對質控樣品的最低檢出量達到8.21 ng/mL，與商品化BOVIGAMTM試劑盒相當。在進行重復性試驗時，不同批內的試劑盒的陽性對照和陰性對照的變異系數分別為3.34%和7.58%，不同批次的試劑盒的陽性對照和陰性對照的變異系數分別為3.74%和8.20%，變異系數均<10%，重復性均良好，檢測結果準確可靠。同時試劑盒的保存期在12個月以上。

臨床試驗顯示，試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒與皮試變態反應相比，陽性一致率為70.59%，陰性一致率為99.20%，總一致率為98.44%；與商品化BOVIGAMTM試劑盒相比，陽性一致率為91.30%，陰性一致率為99.78%，總一致率為99.58%。以皮試變態反應和商品化BOVIGAMTM試劑盒檢測結果作為參考進行分析，結果顯示試制的試劑盒靈敏度達到85.00%，特異度達到100.00%。結果表明，試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒檢測效果較好，有望用于臨床牛結核病的檢測。

本試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒減少了結核菌素皮內變態反應試驗中操作和解釋上的主觀性，使結果更為客觀、可靠，具有較好的特異性和敏感性[17]，且與商品化BOVIGAMTM試劑盒相比，試制的牛結核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒在符合率得到保障的同時成本較低，適合國內推廣。通過將試制的試劑盒與單純皮試變態反應共同檢測牛結核，也可降低假陽性和假陰性檢出率[18-19]，提高檢測的準確性，為我國牛結核病的檢疫和根除提供了一種實用、有效的檢測試劑。

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