幽門螺桿菌Tipα蛋白激活NLRP3炎性小體誘導THP-1細胞分泌IL-1β和IL-18

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腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導蛋白(TNF-α-inducing protein, Tipα) 是新被發現的幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)毒力因子[1]，可與其特異性受體-人和小鼠胃癌細胞株表面的核仁素(nucleolin，又名C23)形成復合物，然后進入胞漿和胞核，通過激活NF-κB誘導TNF-α和趨化因子表達[2]。Tipα與H.pylori致炎、致癌作用密切相關[1-3], 被認為是一種新的“癌蛋白”，但其致病機制目前仍不十分清楚。我們前期研究發現，重組Tipα蛋白(rTipα)可通過激活NF-κB誘導THP-1細胞分泌IL-1β等細胞因子[4]。IL-1β、IL-18等細胞因子的產生及分泌與半胱天冬酶-1(Caspase-1)的活化有關，而Caspase-1的活性又受到胞漿內多蛋白復合體-NLRP3炎性小體(inflammasome)的精確調控[5]。NLRP3活化Caspase-1誘導IL-1β分泌過程如下：首先是病原體分子與其受體如模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)結合，激活NF-κB或激活蛋白-1(activator protein 1, AP-1)，從而導致NLRP3炎性體成份NLRP3、ASC(凋亡相關點樣蛋白)和pro-IL-1β基因的轉錄、表達上調；然后是鉀離子(K+)外流、溶酶體破壞釋放的組織蛋白酶B(Cathepsin B)和活性氧(ROS)等信號促使NLRP3炎性小體的活化、組裝[6]。

本研究擬采用原核表達重組Tipα蛋白處理表面高表達核仁素的人THP-1源性巨噬細胞[7]，采用ELISA、通路阻斷、ROS清除等方法，初步研究NLRP3炎性小體在介導Tipα所致炎癥反應中的作用，為闡明H.pylori持續性感染及引起胃黏膜炎癥反應的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1載體、菌株及細胞株E.coliBL21菌株、pET-30a(+)載體和THP-1細胞為南華大學病原生物學研究所保存；H.pylori-26695國際標準株系本課題組保存。

1.2主要試劑盒 細菌基因組提取試劑盒、DNA快速純化試劑盒、高純質粒小提取試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、His純化樹脂、ECL化學發光顯色試劑盒(康為世紀公司)；去內毒素試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司)；人TNF-α ELISA試劑盒、人IL-1β ELISA試劑盒、人IL-18 ELISA試劑盒(欣博盛公司)。

1.3主要試劑 Tipα目的基因引物(上海生工生物工程有限公司合成);2×Es Taq MasterMix(Dye)、Supper DNA Marker(康為公司)；BamH I、XhoI限制性內切酶、T4連接酶(Thermo公司)；鼠抗His標簽單克隆抗體、羊抗鼠 IgG(+) HRP抗體、羊抗兔IgG(+) HRP抗體、兔抗β-actin抗體、兔抗Caspase-1抗體、兔抗NLRP3 p20亞單位抗體(CST公司)；PDTC(碧云天公司)；蛋白預染Marker (Fermentas公司)；胎牛血清(四季青公司)；RIPA緩沖液 (Thermo公司)；LPS、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、萬古霉素、兩性霉素B、多黏菌素B、三甲氧芐氨嘧啶(TMP)(Sigma公司)。

1.4Tipα目的基因的擴增 在GenBank數據庫中查到Tipα全基因序列，除去信號肽序列后，根據E.coli原核質粒pET-30 a (+)的酶切位點圖譜，將酶切位點和保護性堿基分別加入上下游引物中，使用primer premier 5.0軟件設計Tipα特異性引物，交由上海生工合成，合成的引物序列如下：上游引物5′-CGCGGATCCATGCTGCAGGCTTGCACTT-3′含BamHI酶切位點GGATCC，下游引物5′-CCGCTCGAGCTACATGGCTATAGGGACTT-3′含XhoI酶切位點CTCGAG。培養H.pylori26695標準株，提取菌體全基因組DNA模板。PCR擴增Tipα目的基因，反應條件：預變性94 ℃2 min；變性94 ℃30 s，退火52 ℃)30 s，延伸72 ℃ 30 s，共循環35次；最后一次循環后終延伸72 ℃ 2 min，停止反應并純化目的基因PCR產物。

1.5重組質粒的構建和鑒定 培養含pET-30a (+)質粒的細菌，提取pET-30a (+)質粒，用BamH I和XhoI對Tipα目的基因和pET-30a (+)質粒進行雙酶切，采用T4連接酶于PCR儀中22 ℃連接1 h，65 ℃水浴箱中孵育10 min終止連接反應。制備E.coliBL21和JM109感受態細胞。將連接產物轉化至感受態細菌中，均勻涂于具有卡那霉素抗性的LB固體培養基上，37 ℃培養12 h。菌液PCR、BamHI和XhoI雙酶切、測序鑒定，網上GenBank Blast比對。

1.6Tipα重組蛋白的表達、鑒定和純化 在IPTG濃度為1 mmol/L、30 ℃條件下誘導Tipα重組蛋白表達4 h，Western Blot鑒定，His標簽純化樹脂純化重組蛋白，參照試劑盒說明書對蛋白進行去內毒素處理。

1.7THP-1細胞培養和模型建立 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養THP-1細胞，用佛波酯(PMA)誘導其分化為巨噬細胞。分別用10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL Tipα蛋白對細胞加以刺激，設100 ng/mL的LPS為陽性對照組、PBS為陰性對照組，每組設3個復孔；37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養0 h、3 h、6 h、12 h和24 h后，吸取各孔上清液用于后續試驗。

1.8ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-18水平 具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.9ELISA檢測阻斷信號通路后對各細胞因子表達的影響 將THP-1細胞誘導成巨噬細胞，方法同上。用ROS清除劑NAC(100 μg/mL)或NF-κB特異性抑制劑PDTC(100 ng/mL)預處理細胞30 min，再以40 μg/mL的Tipα刺激細胞，設100 ng/mL的LPS為陽性對照組、PBS為陰性對照組，每組設3個復孔。37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養6 h后，ELISA檢測各孔上清液中細胞因子TNF-α、IL-18和IL-1β的水平。

1.10Western Blot檢測阻斷信號通路前后NLRP3、Caspase-1表達變化 THP-1巨噬細胞處理同前，收集細胞，用Western Blot檢測阻斷信號通路前后NLRP3、Caspase-1(Cleaved Caspase-1 p20亞單位)的表達變化。

2 結 果

2.1Tipα蛋白的表達與鑒定 用菌液PCR、雙酶切及測序對重組質粒pET30a(+)/Tipα進行鑒定。菌液PCR結果顯示，重組質粒轉化后的細菌可見到明顯Tipα DNA條帶；BamH I和XhoI雙酶切及測序證實重組載體構建成功，插入重組載體的Tipα基因序列與GenBank登錄序列符合率為100%；載體可在E.coliBL21(DE3)表達菌內有效表達一個約25 kD大小的單體蛋白，采用不含DTT的SDS-PAGE電泳顯示，表達產物中含有具有活性的二聚體蛋白(圖1)。蛋白經純化后純度達90%以上，Western Blot鑒定Tipα可與His標簽抗體產生特異性反應(圖2)。

1:蛋白Marker；2:不加DTT的Tipα重組蛋白表達純化產物；3:加DTT的Tipα重組蛋白表達純化產物1: Marker; 2: The purified recombinant Tipα protein without DTT;3: The purified recombinant Tipα protein with DTT圖1 Tipα重組蛋白表達純化產物SDS-PAGE電泳結果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant Tipα protein

1: pET30a(+) BL21(空菌); 2: Tipα/pET30a(+) BL21(重組菌)1: pET30a(+) BL21; 2: Tipα/pET30a(+) BL21圖2 Tipα重組蛋白Western Blot(His標簽抗體)鑒定結果Fig.2 Identification of the purified recombinant Tipα protein by Western Blot using His tag antibody

2.2Tipα刺激對THP-1細胞分泌細胞因子的影響 與PBS陰性對照組相比，Tipα重組蛋白處理組TNF-α、IL-18和IL-1β的表達水平明顯升高。用不同濃度Tipα蛋白刺激巨噬細胞12 h，ELISA檢測上述3種細胞因子的表達水平。結果顯示，當Tipα蛋白濃度為40 μg/mL時，細胞因子TNF-α、IL-18和IL-1β的表達水平較高(圖3)；當用40 μg/mL Tipα重組蛋白刺激THP-1細胞不同時間時，細胞因子TNF-α、IL-18和IL-1β在刺激6 h后表達量開始達到高峰，刺激12 h、24 h表達量變化不大(圖4)。根據以上結果分析，用40 μg/mL的Tipα蛋白刺激靶細胞6 h后對靶細胞的影響較強，因此采用該蛋白濃度和刺激時間做后續實驗。

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分別以10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的重組Tipα蛋白刺激巨噬細胞12 h,以100 ng/mL的LPS和PBS作為陽性和陰性對照。(*表示與PBS對照組比較P<0.01)10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 80 μg/mL recombinant Tipα were used respectively to stimulate macrophages for 12 h in 6-well culture plates, and 100 ng/mL of LPS and PBS were used as positive and negative control. (* P<0.01, compared with PBS control group). 圖3 不同濃度Tipα重組蛋白對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-18的影響Fig.3 Effect of different concentrations of recombinant Tipα on the secretion of TNF-α, IL-1β and IL-18 in macrophages

用40 μg/mL的重組Tipα刺激巨噬細胞0 h、3 h、6 h、12 h和24 h。(*表示與0 h組比較，P<0.01)40 μg/mL recombinant Tipα was used to stimulate macrophages for 0 h, 3 h, 6 h, 12 h and 24 h;(*P<0.01, compared with 0 h group).圖4 Tipα重組蛋白刺激不同時間對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-18的影響Fig.4 Effect of recombinant Tipα on the secretion of TNF-α, IL-1β and IL-18 in macrophages at different time points

2.3PDTC對Tipα誘導的促炎細胞因子分泌及Caspase-1、NLRP3表達的影響 用PDTC(NF-κB特異性抑制劑)預處理細胞后，ELISA檢測TNF-α、IL-18和IL-1β水平，發現3種細胞因子表達水平均有下降(圖5A)，表明Tipα通過NF-κB通路誘導巨噬細胞產生細胞因子。Western Blot結果表明，阻斷NF-κB通路后Caspase-1和NLRP3分子的表達均減少(圖5B)，表明Tipα蛋白可通過NF-κB通路誘導NLRP3、Caspase-1表達及活化。

(A)PDTC對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-18和IL-1β的影響 (B)PDTC對巨噬細胞表達Caspase-1和NLRP3的影響用40 μg/mL的重組Tipα蛋白刺激巨噬細胞6 h,以100 ng/mL的LPS和PBS作為陽性和陰性對照，顯示的是有代表性的結果。*表示與(LPS+P)組比較P<0.05;+表示與(Tipα+P)組比較，P<0.05,P:PDTC(A) Effect of PDTC on the secretion of TNF-α, IL-18 and IL-1β in macrophages. (B) Effect of PDTC on the expression of Caspase-1 and NLRP3 in macrophages. 40 μg/mL recombinant Tipα was used to stimulate macrophages for 6 h in 6-well culture plates, and 100 ng/mL of LPS and PBS were used as positive and negative control respectively. Representative results are shown. *P<0.05, compared with (LPS+P) group; + P<0.05, compared with (Tipα+P) group. P: PDTC. 圖5 PDTC預處理對促炎細胞因子分泌及NLRP3、Caspase-1表達的影響Fig.5 Effect of PDTC pretreatment on secretion of proinflammatory cytokines and expression of Caspase-1 and NLRP3 in macrophages

2.4NAC對Tipα誘導的促炎細胞因子分泌及Caspase-1、NLRP3表達的影響 NAC預處理巨噬細胞后，ELISA檢測發現其能抑制Tipα誘導的促炎細胞因子IL-18和IL-1β分泌水平，而TNF-α表達水平無明顯變化(圖6A)。Western Blot結果顯示，NAC可以抑制Tipα誘導的Caspase-1和NLRP3表達及活化(圖6B)，表明NLRP3/Caspase-1通路在Tipα誘導巨噬細胞分泌IL-18和IL-1β過程中可能發揮重要作用。

(A)NAC對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-18和IL-1β的影響(B)NAC對巨噬細胞表達Caspase-1和NLRP3的影響用40μg/mL的重組Tipα蛋白刺激巨噬細胞6 h,以100 ng/mL的LPS和PBS作為陽性和陰性對照，顯示的是有代表性的結果。*表示與(LPS+N)組比較P<0.05;+表示與(Tipα+N)組比較，P<0.05,P:NAC(A) Effect of NAC on the secretion of TNF-α, IL-18 and IL-1β in macrophages. (B) Effect of NAC on the expression of NLRP3 and Caspase-1 in macrophages. 40 μg/mL recombinant Tipα was used to stimulate macrophages for 6 h in 6-well culture plates, and 100 ng/mL of LPS and PBS were used as positive and negative control respectively. Representative results are shown. *P<0.05, compared with (LPS+N) group; + P<0.05, compared with (Tipα+N) group. N: NAC.圖6 NAC預處理對促炎細胞因子分泌及NLRP3、Caspase-1表達的影響Fig.6 Effect of NAC pretreatment on the secretion of proinflammatory cytokines and expression of NLRP3 and Caspase-1 in macrophages

3 討 論

H.pylori可通過誘導促炎細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和各種趨化因子等引起微環境的炎癥，從而導致慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及胃癌。1994年，國際癌癥研究機構把H.pylori歸為I類致癌原。H.pylori具有許多毒力因子，毒力因子的差異是導致不同臨床結局發生的重要因素之一[8]。Tipα是倍受關注的H.pylori新的毒力因子，一般以二聚體形式發揮活性，且以不依賴Cag致病島(cagPAI)的方式激活NF-κB誘導TNF-α和各種趨化因子的表達。臨床研究表明，Tipα與H.pylori引起的嚴重胃炎、胃腺癌密切相關[1-3]。

NLRP3炎性小體是參與固有免疫的胞內多蛋白復合物，能感知外源或內源危險信號，從而引起炎性小體的組裝及Caspase-1的活化，進一步加工、剪切IL-1β、IL-18和IL-33前體(pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33)，促進這些細胞因子的成熟與分泌，調控免疫應答和炎癥反應[5]。研究表明，NF-κB或AP-1激活可導致NLRP3、ASC和pro-IL-1β基因轉錄、表達上調，但NLRP3炎性小體的活化、組裝并不依賴于NF-κB。目前認為NLRP3炎性小體的激活主要存在3種機制[6]：ROS產生、溶酶體破壞釋放Cathepsin B和K+外流招募半通道蛋白(Pannexin-1)形成質膜孔道，其中ROS的作用最強。

巨噬細胞是機體重要的免疫調節和效應細胞，在H.pylori感染引起的炎癥反應中發揮著重要的作用[9]。本研究首先以基因克隆表達技術獲得了二聚體形式的Tipα重組蛋白，然后以去內毒素的重組純化Tipα蛋白處理人單核細胞THP-1源性巨噬細胞，發現Tipα可以濃度依賴性和時間依賴性方式誘導THP-1細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-18；NF-κB抑制劑PDTC預處理能夠抑制Tipα誘導的這3種細胞因子的分泌和NLRP3、Caspase-1的表達。說明NF-κB是NLRP3炎性小體活化過程中的一個重要中間環節，Tipα誘導的NF-κB激活可上調NLRP3、Caspase-1和pro-IL-1β、TNF-α基因的轉錄和表達。

同樣，ROS清除劑NAC預處理細胞可明顯減少Tipα誘導的IL-1β和IL-18分泌，而TNF-α的分泌無明顯差異，這表明TNF-α的分泌并不受NLRP3炎性小體的調控，而是與NF-κB的激活有關，這與TNF-α的產生不依賴于NLRP3的研究結論一致[10]，而IL-1β和IL-18的表達則受NLRP3炎性小體的調控。研究表明ROS可影響NF-κB信號的活化[11]，TNF-α既是NF-κB的下游因子，亦能誘導NF-κB活化。本文結果NAC預處理細胞后TNF-α的分泌無明顯差異，這可能與TNF-α受NF-κB、MAPK、JNK多條通路調控有關，其中以NF-κB的調控作用為主[12]。

細胞內ROS的產生有多種來源，目前認為參與NLRP3活化的胞內ROS主要來源于胞膜NADP/NADPH系統激活和線粒體損傷[14]。研究表明，使用ROS的化學清除劑、抑制NADPH氧化酶或siRNA干擾NADPH氧化酶亞單位p22phox從而抑制 ROS 的產生均可廣泛抑制NLRP3炎性小體的活化[15-16]。另有研究表明，ROS可直接促使硫氧還蛋白結合蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)與NLRP3結合，從而激活NLRP3炎性小體[17]，促進炎癥反應的發生。

研究表明，H.pylori全菌誘導產生的ROS參與了NLRP3炎性小體的活化[18]，但該過程中ROS產生的來源仍不清楚。H.pylori多個毒力因子如空泡毒素(VacA)、γ-谷氨酰轉肽酶(gGT)均能夠誘導胞內ROS的產生[18]，Tipα與其胞膜表面受體核仁素結合進入細胞后是否可以誘導ROS的產生尚需進一步研究。

本文初步研究了NLRP3炎性小體在H.pylori新毒力因子Tipα蛋白誘導細胞因子分泌中的作用。結果表明Tipα誘導THP-1來源的巨噬細胞分泌IL-1β和IL-18與NLRP3炎性小體的激活有關，并且ROS可能參與了該激活過程，此激活過程是ROS單獨參與還是與其它因素有關，有待于進一步研究和驗證。本研究為Tipα致病機制的認識提供了新的依據。

[1] Suganuma M, Kurusu M, Suzuki K, et al. New tumor necrosis factor-alpha-inducing protein released fromHelicobacterpylorifor gastric cancer progression[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2005, 131(5): 305-313. DOI: 10.1007/s00432-004-0652-x

[2] Watanabe T, Tsuge H, Imagawa T, et al. Nucleolin as cell surface receptor for tumor necrosis factor-alpha inducing protein: a carcinogenic factor ofHelicobacterpylori[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136(6): 911-921. DOI: 10.1007/s00432-009-0733-y

[3] Wu WB,Cai PW，Fang CY, et al. Detection of clarithromycin resistance inHelicobacterpyloriby denaturing high performance liquid chromatography assay[J]. Chin J Zoonoses, 2015,31 (11): 1050-1053. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.013 (in Chinese)

吳文冰,蔡鵬威,方超英,等.應用變性高效液相色譜法檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性[J]．中國人獸共患病學報，2015,31 (11): 1050-1053.

[4] Zhong Y, Zhang Y. Tumor necrosis factor-α inducing protein ofHelicobacterpyloriinduces cytokines production in macrophages through activation of NF-κB [D]. Hengyang: University of South China, Master’s thesis, 2014. (in Chinese)

鐘軼,張艷. 幽門螺桿菌Tipα蛋白經激活NF-κB誘導巨噬細胞分泌細胞因子[D]. 衡陽: 南華大學,2014.

[5] Lamkanfi M, Dixit VM. Mechanisms and functions of inflammasomes[J]. Cell, 2014, 157(5): 1013-1022. DOI: 10.1016/j.cell.2014.04.007

[6] Franchi L, Muoz-Planillo R, Núez G. Sensing and reacting to microbes through the inflammasomes[J]. Nat Immunol, 2012, 13(4): 325-332. DOI: 10.1038/ni.2231

[7] Barel M, Meibom K, Charbit A. Nucleolin, a shuttle protein promoting infection of human monocytes byFrancisellatularensis[J]. PLoS One, 2010, 5(12): e14193. DOI: 10.1371/journal.pone.0014193

[8] Yamaoka Y, Graham DY.Helicobacterpylorivirulence and cancer pathogenesis[J]. Future Oncol, 2014, 10(8): 1487-1500. DOI: 10.2217/fon.14.29

[9] Gobert AP, Cheng Y, Wang JY, et al.Helicobacterpyloriinduces macrophage apoptosis by activation of arginase II[J]. J Immunol, 2002, 168(9): 4692-4700. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.168.9.4692

[10] Kim DJ, Park JH, Franchi L, et al. The Cag pathogenicity island and interaction between TLR2/NOD2 and NLRP3 regulate IL-1β production inHelicobacterpyloriinfected dendritic cells[J]. Eur J Immunol, 2013, 43(10): 2650-2658. DOI: 10.1002/eji.201243281

[11] Morgan MJ, Liu ZG. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-κB signaling[J]. Cell Res, 2011, 21(1): 103-115. DOI: 10.1038/cr.2010.178

[12] Brown MD, Sacks DB. Compartmentalised MAPK pathways[J]. Handb Exp Pharmacol, 2008, (186): 205-235. DOI: 10.1007/978-3-540-72843-6_9

[13] Zheng Q, Ren Y, Reinach PS, et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes prime environment-induced murine dry eye[J]. Exp Eye Res, 2014, 125: 1-8. DOI: 10.1016/j.exer.2014.05.001

[14] Abais JM, Xia M, Zhang Y, et al. Redox regulation of NLRP3 inflammasomes: ROS as trigger or effector?[J]. Antioxid Redox Signal, 2015, 22(13): 1111-1129. DOI: 10.1089/ars.2014.5994

[15] Cruz CM, Rinna A, Forman HJ, et al. ATP activates a reactive oxygen species-dependent oxidative stress response and secretion of proinflammatory cytokines in macrophages[J]. J Biol Chem, 2007, 282(5): 2871-2879. DOI: 10.1074/jbc.M608083200

[16] Dostert C, Pétrilli V, Van Bruggen R, et al. Innate immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica[J]. Science, 2008, 320(5876): 674-677. DOI: 10.1126/science.1156995

[17] Zhou R, Tardivel A, Thorens B, et al. Thioredoxin-interacting protein links oxidative stress to inflammasome activation[J]. Nat Immunol, 2010, 11(2): 136-140. DOI: 10.1038/ni.1831

[18] Semper RP, Mejías-Luque R, Groβ C, et al.Helicobacterpylori-induced IL-1β secretion in innate immune cells is regulated by the NLRP3 inflammasome and requires the Cag pathogenicity island[J]. J Immunol, 2014, 193(7): 3566-3576. DOI: 10.4049/jimmunol.1400362