云南西部地區家畜動物感染巴貝蟲的分子流行病學調查

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巴貝蟲屬(Babesia)隸屬于原生動物亞界(Protozoa)，頂器復合門(Apicomplexa)，孢子蟲綱(Sporozoasida)，梨形蟲亞綱(Piroplasmia)，梨形蟲目(Piroplasmorida)，巴貝蟲科(Babesiidae)[1]。巴貝蟲寄生于哺乳動物紅細胞內，主要經蜱蟲叮咬傳播，也可經輸血和經胎盤傳播[2]。巴貝蟲屬成員繁多，有100多種，目前已明確可感染人類的巴貝蟲有6種,即分歧巴貝蟲(B.divergens)、微小巴貝蟲(B.microti)、鄧肯巴貝蟲(B.duncani)、獵戶巴貝蟲(B.venatorum)，巴貝蟲KO1型和近期發現的Babesiasp. XXB/HangZhou.[3]。人感染巴貝蟲后，常有寒顫、高熱、出汗、頭疼和厭食等癥狀，導致溶血性貧血和血小板減少。家畜可作為巴貝蟲的宿主，成為病原攜帶者和重要傳染源。感染家畜動物的巴貝蟲種類較多，其中分歧巴貝蟲與人類感染有關。動物感染后，出現發熱、貧血、血紅蛋白尿、共濟失調等癥狀，若治療不及時，病死率較高，給畜牧業造成嚴重損失。

既往調查資料顯示，云南省分布有46種蜱，是中國蜱種最多的省[4]，也是人巴貝蟲病和家畜動物巴貝蟲病的高發地區[5-9]，國內首次報道的人巴貝蟲病就來自云南省[6]。近年來云南省的農業、畜牧業快速發展，且少數民族眾多，經濟相對落后，自然環境復雜多樣，給巴貝蟲的長期保存、疾病傳播和流行提供了條件。因此了解云南省家畜動物的巴貝蟲感染狀況非常有意義，可為人類和家畜巴貝蟲病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1標本采集 以云南省德欽縣、香格里拉縣、福貢縣、貢山縣、蘭坪縣，華坪縣、劍川縣、云龍縣、漾濞縣、盈江縣、耿馬縣和勐臘縣等12個縣的1 073只家畜動物為研究對象，詳細采樣信息見表1。采樣區分布見圖1。用一次性靜脈采血針和EDTA抗凝管采集家畜動物股靜脈血，立即放入冷藏箱中保存，帶回實驗室進行相關檢測。

圖1 調查采樣區分布圖Fig.1 Distribution of sampling area

表1 樣本采集資料
Tab.1 Sample selection data

調查點surveyingsite牛cattle羊sheep馬horse驢donkey犬dog合計total德欽縣Deqin4500057102香格里拉縣Shangri-La7624000100福貢縣Fugong0000139139貢山縣Gongshan0000120120蘭坪縣Lanping03000030華坪縣Huaping0103000103劍川縣Jianchuan06533170115云龍縣Yunlong1189000100漾濞縣Yangbi5050000100盈江縣Yingjiang9200012104耿馬縣Gengma03400034勐臘縣Mengla00002626合計total27439533173541073

1.2試劑與設備 血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit, lot:03625)，DreamTaq Green PCR Master Mix(2×) (Thermo Fisher Scientific)，DL2000 DNA Marker(Takara)，凝膠成像儀(Syngene)、PCR儀(SENSO,LabCycler Gradient Fuses型)，水平電泳槽JY-SPFT型。

1.3 方法

1.3.1提取基因組DNA 取200 μL血液到2 mL PE管中，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.2PCR擴增 采用降落巢氏PCR擴增巴貝蟲18SrRNA基因。第1輪PCR引物為Piro0F(5′-GCCAGTAGTCATATGCTTGTGTTA-3′)和Piro6R(5′-CTCCTTCCTYTAAGTGATAAGGTTCAC-3′)；第2輪PCR引物為Piro1F(5′-CCATGCATGTCTWAGTAYAARCTTTTA-3′)和Piro5.5R(5′-CCTYTAAGTGATAAGGTTCACAAAA-CTT-3′)[10]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

反應條件：第1輪和第2輪PCR均采用降落巢氏PCR，即95 ℃預變性3 min，前20個循環：95 ℃變性30 s，60 ℃→50 ℃退火30 s(每個循環退火溫度下降0.5 ℃)和72 ℃延伸90 s，后10個循環：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s，最后72 ℃終延伸7 min。預期片段大小為1 600 bp。

1.3.3序列測定與分析 PCR產物送北京天一輝遠公司進行雙向測序。利用CLC Genomics Workbench 3.6.1將所得序列進行拼接。將拼接好的序列與“Blast Sequence Similarity Searching Tool(NCBI)” 查找到的參考序列進行同源性比對。利用MEGA6.06軟件構建系統進化樹。

2 結 果

2.1PCR擴增產物電泳結果 家畜動物血液基因組DNA的PCR擴增產物1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測出現約1 600 bp大小的條帶。與預期目標條帶相符，部分結果見圖2。

M：DNA marker；N：陰性對照；37-47號：樣本。M：DNA marker；N：negative control；37-47：samples圖2 香格里拉部分牛血來源的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products isolated from some cattle blood samples in Shangri-La

2.2 測序結果分析

2.2.1牛血檢測結果 測序結果顯示，在5個縣的274份牛血中，檢測出牛巴貝蟲陽性4份，總陽性率為1.46%；雙芽巴貝蟲陽性7份，總陽性率為2.55%。其中，香格里拉縣檢測出了牛巴貝蟲的陽性率為5.26%，雙芽巴貝蟲的陽性率為6.58%；漾濞縣檢測出了雙芽巴貝蟲的陽性率為4.00%；盈江縣、云龍縣和德欽縣的牛血中未檢測出陽性樣本(表2)。

檢測出的部分序列在GenBank注冊序列號為：KY805823-805833，與GenBank中比對到的參考序列構建系統進化樹(圖3)。其中來自香格里拉的2份樣本(編號：XG45、XG35，對應的GenBank注冊號：KY805824、KY805825)和漾濞的2份樣本(編號：YB46、YB41，對應的GenBank注冊號：KY805823、KY805826)與雙芽巴貝蟲昆明株(AY603402)、廣東株(JQ723014)位于同一大分支，同源性達99%；來自香格里拉的3份樣本(編號： XG44、XG97、XG64，對應的GenBank注冊號： KY805828、KY805829、KY805827)和雙芽巴貝蟲湖北株(HQ840960)、盧氏株(JX495402)位于同一大分支，同源性達99%；來自香格里拉的3份樣本(XG37、XG83、XG65，對應的GenBank注冊號：KY805831、KY805833、KY805832)和牛巴貝蟲巴西株(EF458213)、美國株(HQ264111)位于同一大分支，同源性達99%；另有來自香格里拉的1份樣本(編號：XG95，對應的GenBank注冊號：KY805830)與牛巴貝蟲南非株L19077、巴西株FJ426364位于同一大分支，同源性達99%。間日瘧原蟲(Plasmodium vivax，JQ627158)為外類群。

2.2.2羊血檢測結果 在7個縣的395份羊血中，檢出奧氏巴貝蟲樣寄生蟲陽性37份，總陽性率為9.37%；檢出狍巴貝蟲樣寄生蟲陽性1份，總陽性率為0.25%。劍川縣、蘭坪縣、云龍縣和漾濞縣的奧氏巴貝蟲樣寄生蟲陽性率分別為40.00%、13.33%、5.62%和4.00%。耿馬縣的狍巴貝蟲樣寄生蟲陽性率為2.94%。華坪縣和香格里拉縣未檢測出陽性(表2)。檢測出的部分序列在GenBank中注冊序列號為KY805834-805843，構建系統進化樹，見圖3。所有陽性樣本聚在一小分支內，且與奧氏巴貝蟲、狍巴貝蟲和分歧巴貝蟲在一大分支內。其中耿馬縣樣本(編號：GM19，GenBank注冊號：KY805834)與狍巴貝蟲德國株(KM657248)同源性最高，為98.3%。來自劍川縣、蘭坪縣、云龍縣和漾濞縣的37份陽性樣本與奧氏巴貝蟲加拿大株(KC460321)同源性最高，為97.7%～98.1%。

表2 家畜動物血液檢測結果
Tab.2 Detection results of domestic animals blood

樣本名稱Samples調查點Surveyingsite檢測數TestingNo.牛巴貝蟲陽性率%PositiverateofB.bovis%雙芽巴貝蟲陽性率%PositiverateofB.bigemina%奧氏巴貝蟲樣寄生蟲陽性率%PositiverateofB.odocoilei-likeparasites%狍巴貝蟲樣寄生蟲陽性率%PositiverateofB.capreoli-likeparasites%韋氏巴貝蟲陽性率%PositiverateofB.canisvogeli%牛血cattleblood香格里拉Shan-gri-La765.26(4/76)6.58(5/76)0(0/76)0(0/76)0(0/76)漾濞Yangbi500(0/50)4.00(2/50)0(0/50)0(0/50)0(0/50)盈江Yingjiang920(0/92)0(0/92)0(0/92)0(0/92)0(0/92)云龍Yunlong110(0/11)0(0/11)0(0/11)0(0/11)0(0/11)德欽Deqin450(0/45)0(0/45)0(0/45)0(0/45)0(0/45)小計subtotal2741.46(4/274)2.55(7/274)0(0/274)0(0/274)0(0/274)羊血sheepblood華坪Huaping1030(0/103)0(0/103)0(0/103)0(0/103)0(0/103)劍川Jianchuan650(0/65)0(0/65)40.00(26/65)0(0/65)0(0/65)蘭坪Lanping300(0/30)0(0/30)13.33(4/30)0(0/30)0(0/30)云龍Yunlong890(0/89)0(0/89)5.62(5/89)0(0/89)0(0/89)耿馬Gengma340(0/34)0(0/34)0(0/34)2.94(1/34)0(0/34)香格里拉Shan-gri-La240(0/24)0(0/24)0(0/24)0(0/24)0(0/24)漾濞Yangbi500(0/50)0(0/50)4.00(2/50)0(0/50)0(0/50)小計subtotal3950(0/395)0(0/395)9.37(37/395)0.25(1/395)0(0/395)犬血dogblood德欽Deqin570(0/57)0(0/57)0(0/57)0(0/57)0(0/57)福貢Fugong1390(0/139)0(0/139)0(0/139)0(0/139)0(0/139)貢山Gongshan1200(0/120)0(0/120)0(0/120)0(0/120)0(0/120)盈江Yingjiang120(0/12)0(0/12)0(0/12)0(0/12)0(0/12)勐臘Mengla260(0/26)0(0/26)0(0/26)0(0/26)3.85(1/26)小計subtotal3540(0/354)0(0/354)0(0/354)0(0/354)0.28(1/354)馬血horseblood劍川Jianchuan330(0/33)0(0/33)0(0/33)0(0/33)0(0/33)驢血donkeyblood劍川Jianchuan170(0/17)0(0/17)0(0/17)0(0/17)0(0/17)合計total/10730.37(4/1073)0.65(7/1073)3.45(37/1073)0.09(1/1073)0.09(1/1073)

●為本研究的序列● are the sequences in this research圖3 巴貝蟲18S rRNA基因系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on 18S rRNA genes of Babesia

2.2.3犬血檢測結果 本研究共檢測采自5個縣的犬血樣本354份，僅勐臘縣的1份樣本檢測出韋氏巴貝蟲(B.canisvogeli)，陽性率0.28%(表2)。

陽性樣本(編號：ML09)的序列注冊序列號為：KY805844，在構建的系統進化樹中與韋氏巴貝蟲聚在一個大分支，與臺灣株(HQ148664)同源性最高，為99.7%(圖3)。

3 討 論

家畜可作為巴貝蟲的宿主，是重要的病原攜帶者和傳染源。因此，可作為巴貝蟲病流行病學調查研究的指示動物和研究對象。感染家畜動物的巴貝蟲的種類較多，感染牛亞科動物的有7種、感染羊亞科動物的有9種、犬、馬、豬等家畜可被其它巴貝蟲感染[11]。家畜動物被巴貝蟲感染后，如不及時治療，往往造成批量死亡，給畜牧業造成嚴重的經濟損失。有些巴貝蟲對人有致病性，如分歧巴貝蟲、微小巴貝蟲等，動物染病給人群健康構成一定的威脅。本調查發現云南西部地區12個縣的1 073份家畜動物血液樣本中，共有7個縣的牛、羊、犬檢出5種巴貝蟲及巴貝蟲樣寄生蟲50份，總陽性率為4.66%。

我國已報道的可以感染牛的巴貝蟲有：牛巴貝蟲、雙芽巴貝蟲、分歧巴貝蟲和東方巴貝蟲。牛被巴貝蟲感染后，癥狀往往較嚴重，病死率較高。在云南省，大理市[12]、玉龍縣[13]、蘭坪縣[14]、云縣[15]先后報道了牛巴貝蟲病，云縣某肉牛養殖場黃牛巴貝蟲病的發病率達1.14%。本研究牛血檢測出了巴貝蟲的總陽性率為1.46%，在香格里拉牛血樣本中檢出兩種巴貝蟲；漾濞縣的牛血樣本中檢出雙芽巴貝蟲，該地區屬云南藏區，畜牧業是當地的支柱產業，家畜多為成群放養，極易使巴貝蟲在不同牛之間迅速傳播而使疫情快速擴大。

據文獻記載目前奧氏巴貝蟲主要感染鹿科動物，在羊亞科動物中，只有沙漠大角羊(Oviscanadensisnelsoni)和捻角山羊(Caprafalconeri)被奧氏巴貝蟲感染[16-17]。而在本次調查中劍川縣是檢測出奧氏巴貝蟲樣寄生蟲(37/395)陽性率最高的地區。此外，在耿馬縣檢出1份狍巴貝蟲樣寄生蟲(B.capereoli-like parasites)，耿馬縣是我國首次報道人巴貝蟲病的地區，但由于當時檢測技術手段的限制，未作巴貝蟲種類的鑒定，也未查明其來源于何種動物[6]。在本研究之前，未查見關于耿馬縣巴貝蟲感染羊的調查報告，且云南省尚未報道過奧氏巴貝蟲和狍巴貝蟲，所以，這次的發現對云南省不同種巴貝蟲的存在提供了基線資料。

犬是人類的伴侶動物，它可以將野外蜱帶入到人類的住所內，從而增加了人類感染蜱媒疾病的風險。目前，犬可以感染的巴貝蟲有犬巴貝蟲(B.canis)和吉氏巴貝蟲(B.gibsoni)，犬巴貝蟲包括B.caniscanis、韋氏巴貝蟲(B.canisvogeli)、羅氏巴貝蟲(B.canisrossi)3個亞種，但是這些巴貝蟲目前認為對人類均不致病。此前，云南省曾有犬巴貝蟲[14]和巴貝蟲未定種(Babesiasp.)[19]感染犬的報道，本次研究在354份犬血中檢測到韋氏巴貝蟲陽性1份，也首次從分子水平證實了云南省的犬存在韋氏巴貝蟲的感染。

云南地處中國西南邊陲，屬青藏高原南延部分，復雜的地形地貌、氣候條件、森林植被和生態環境，形成了多種自然疫源性疾病長期保存、發生和流行的地理環境和自然條件。同時因山區較多，經濟相對落后，養殖業是許多地方農業人口的主要經濟來源，近年來規模養殖也得到快速發展。本研究在多地動物血液中檢出不同的巴貝蟲，有的種類致病性及與人類疾病的關系不甚清楚。大理、永勝、梁河等地有牛、羊、豬等動物巴貝蟲病暴發流行的報道[12,20-21]。蜱蟲攜帶和傳播的病原體種類較多，提示在發展畜牧業的同時，需加強動物圈舍、動物體表的滅蜱，對購入或調出的家畜加強檢疫，嚴防巴貝蟲病及其它動物疫病的帶入或傳出，以確保人群和家畜的健康。

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