miR-204在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

潘兆寶 吉華青 韓麗芳 董安山 史立宏

261000濰坊市第二人民醫(yī)院1

261000濰坊醫(yī)學(xué)院2

本研究特對78例肺癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行對照研究，以期明確miR-204在肺癌組織中相對表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系，為該基因表達(dá)在肺癌發(fā)病過程中作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

研究設(shè)計：本研究采用前瞻性、空白對照方法設(shè)計、開展試驗探究。

研究對象：選取我院2014年6月-2016年4月行肺癌切除術(shù)的78例石蠟存檔組織標(biāo)本作為研究對象。取肺癌組織作為試驗組，取癌旁正常組織(距癌癥組織≥3 cm)作為對照組。78例患者均為原發(fā)性肺癌，且符合孫麗慧2011年《現(xiàn)代腫瘤學(xué)》中肺癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中男42例，女36例；年齡45～72歲，平均(58.72±5.13)歲；病程1～30個月，平均(16.78±5.04)個月；腫瘤長徑2.0～7.7 cm，平均(4.32±0.71)cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無55例；TNM分期為Ⅰ期32例，Ⅱ期25例，≥Ⅲ期21例；分化程度為高分化27例，中分化29例，低分化22例；組織類型為鱗癌39例，腺癌19例，非小細(xì)胞癌14例，其他6例。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均為原發(fā)性肺癌，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)；②均行根治性切除術(shù)，且符合手術(shù)指征；③切除組織均行石蠟存檔處理。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型原發(fā)性惡性腫瘤，肺部轉(zhuǎn)移者；②肺部良性腫瘤者；③合并其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者。

試劑和儀器：Trizol RNA提取試劑盒(購自美國Invitrogen公司)；熒光定量RT-PCR反轉(zhuǎn)錄和定量染料(均購自大連Takara寶生物工程公司)；miRNA探針和引物(購自美國ABI公司)；臺式離心機(jī)(TDM5L型，購自湖南湘儀儀器公司)；超低溫冰箱(MDF-U53V型，購自日本Sanyo集團(tuán))；RNA評估系統(tǒng)(Agilent 2100型，購自安捷倫科技公司)；熒光定量RT-PCR儀器(7900HT型，購自美國ABI公司)；miR-204逆轉(zhuǎn)錄引物序列(由美國ABI公司設(shè)計并合成)。

miRNA提取方法：采用Trizol提取總RNA，具體方法如下：①取試驗組和對照組組織，逐漸添加液氮同時將其研磨，依次加入Buffer-Ⅰ裂解液和Buffer-Ⅱ裂解液，注意此過程中需要抽提；②行離心分離處理，將沉渣撇去后添加無水乙醇，并行離心處理，去濾液并將其中加入異丙醇，離心分離后將上清液撇去，添加濃度70%的乙醇，放置-20℃的恒溫冰箱中預(yù)冷后行離心分離處理，將上清液撇去，上述所有離心分離過程中轉(zhuǎn)速均設(shè)置為12 000 r/min，時間5 min；③將沉淀采用Buffer TE水洗脫miRNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量RT-PCR檢測方法：①取上述步驟所得樣品5 μL，向其中加入miR-204逆轉(zhuǎn)錄引物并行擴(kuò)增實(shí)驗；②內(nèi)參設(shè)置為U6RNA，反應(yīng)總體積10 μL(需用無RNA酶H2O將反應(yīng)體系補(bǔ)充至10 μL)；③PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，58℃水浴20 s，完成45個循環(huán)后，72℃退火30 s。在此過程中需注意將內(nèi)參U6RNA進(jìn)行擴(kuò)增以作為對照；④取裂解液PLB，用超純水稀釋5倍后加入反應(yīng)體系終止反應(yīng)后加入LA工作液100 μL，并采用熒光系統(tǒng)對miR-204表達(dá)熒光相對含量進(jìn)行檢測。

觀察指標(biāo)和判定標(biāo)準(zhǔn)：①對比試驗組和對照組miR-204表達(dá)熒光相對含量；②對比不同臨床病理條件下miR-204表達(dá)熒光相對含量。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 17.0分析，計量資料采用(x±s)表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用率(%)表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

試驗組和對照組miR-204表達(dá)熒光相對含量比較：試驗組miR-204表達(dá)熒光相對含量水平較對照組顯著降低，兩組數(shù)據(jù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組miR-204表達(dá)熒光相對含量比較(x±s)

兩組miR-204熒光相對含量水平檢測圖(略)。

不同臨床病理條件下miR-204表達(dá)熒光相對含量比較：miR-204表達(dá)熒光相對含量在性別、年齡方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而在病程、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度和組織類型等不同臨床病理條件下其熒光相對含量水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中病程≥12個月、腫瘤長徑≥5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM≥Ⅲ期、低分化和非小細(xì)胞肺癌miR-204表達(dá)熒光相對含量水平均遠(yuǎn)低于病程＜12個月、腫瘤長徑＜5 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ期和Ⅱ期、高分化和中分化、鱗癌和腺癌等含量水平，見表2。

表2 不同臨床病理條件下miR-204表達(dá)熒光相對含量比較(x±s)

討 論

目前臨床上對肺癌發(fā)生和進(jìn)展作用機(jī)制研究尚淺，僅有既往相關(guān)研究證實(shí)抽煙、藥物作用、生活和社會環(huán)境壓力增大等均是肺癌發(fā)生的危險因素。隨著分子生物學(xué)和醫(yī)療技術(shù)水平的不斷發(fā)展和進(jìn)步，基因突變成為當(dāng)前公認(rèn)的癌癥發(fā)生的根本原因，且臨床上針對肺癌患者采用放化療有效性和敏感性均和多種相關(guān)基因表達(dá)水平存在關(guān)聯(lián)[2，3]。目前關(guān)于肺癌遺傳易感性和放化療有效性研究較多的基因，當(dāng)屬BCL-2、HMGA2、DHH、DTX1等，均有實(shí)驗動物模型或體外細(xì)胞實(shí)驗證實(shí)其可能參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程[5-6]。相關(guān)研究指出，上述基因在胃癌中也可能具有重要參與作用，通過對miRNAs作用調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)和功能，進(jìn)而誘導(dǎo)并促進(jìn)胃癌發(fā)生，其中以miR-204作用最為明顯[7]。因此探究miR-204在肺癌組織中表達(dá)水平及其和臨床病理的關(guān)系，對確定其是否參與肺癌發(fā)生和進(jìn)展、明確其作用機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。

miR-204具有多種生物學(xué)作用，在人體9號染色體上，對骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓間質(zhì)母細(xì)胞的分化均具有重要調(diào)控作用。在不同類型的腫瘤發(fā)生過程中，miR-204表達(dá)水平和調(diào)控機(jī)制存在明顯不同。國外報道指出[8，9]，miR-204可以顯著抑制致癌相關(guān)蛋白水平，但是在子宮內(nèi)膜樣癌、宮頸癌、卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤中其表達(dá)水平均表現(xiàn)出顯著降低趨勢，提示miR-204對多種婦科惡性腫瘤具有顯著抑制作用，推測其靶基因很可能是具有積極作用，能夠增強(qiáng)放化療有效率的抑癌基因。另有研究通過體外人膽管癌細(xì)胞系miR-204培養(yǎng)和檢測研究[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性的miR-204能夠顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞凋亡率，且激發(fā)化療藥物5-氟尿嘧啶的療效，且Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著被抑制，推測和Bcl-2受到miR-204負(fù)向調(diào)控作用有關(guān)。在一項關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)[11]，miR-204過表達(dá)可顯著抑制病情惡化和進(jìn)展，對抑制遷移、侵襲、浸潤均具有顯著調(diào)控作用。

本研究結(jié)果中，試驗組miR-204表達(dá)熒光相對含量較對照組顯著降低，且在病程、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度和組織類型等臨床病理條件下其表達(dá)水平均差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，提示miR-204低表達(dá)不僅和肺癌的發(fā)生關(guān)系緊密，對其侵襲、轉(zhuǎn)移、浸潤也很可能存在一定調(diào)控作用。但是其具體作用機(jī)制尚需深入探究，期待更多學(xué)者積極探索，為肺癌臨床防治提供更為合理、高效的方案。

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