“調宗氣”組方對慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響

130021長春中醫藥大學附屬醫院

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是一種常見的呼吸疾病，表現為睡眠過程中反復發生上氣道阻塞，導致通氣降低或停止，同時可伴有低氧血癥[1]。OSAHS患者可出現白天困倦、乏力、注意力不集中、頭暈、胸悶、心慌、性功能減退等多臟器、多系統功能損害，嚴重影響患者的生活質量[2-6]。本課題組以“調宗氣”理論為基礎運用自主設計的湯方、外用塌漬、針灸治療OSAHS，已取得了成效。上氣道擴張肌活性異常在OSAHS發生、發展中起著重要作用，而頦舌肌為上氣道最主要擴張肌，經臨床和基礎研究證實，其功能異?？蓪е律蠚獾篱]陷而引發疾病。因此，本研究擬通過“調宗氣”理論指導下組方對慢性間歇性缺氧大鼠頦舌肌鈣離子濃度影響的研究，找到“調宗氣”法有效治療OSAHS的作用機理，為尋找更加有效的治療方法提供科學依據，將“調宗氣”這一獨特中醫理論充分運用并有效指導臨床治療。

資料與方法

實驗動物：實驗選取健康Wistar大鼠，雄性，體重220～250 g，10只；體重350～400 g，50只，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物合格證號為SCXK(遼)2015-0001。在長春中醫藥大學研發中心飼養，飼養條件為室溫18～22℃，濕度50%～70%，自然光照，大鼠正常飼養，每5只一籠，自由飲食。

藥品與試劑：調宗氣湯方藥物組成：黃芪，黨參，陳皮，法半夏，茯苓，白術，炙甘草，蘇子，萊菔子，地龍等。購自于長春中醫藥大學附屬醫院免煎室，由長春中醫藥大學研發中心制作。

Ca離子濃度比色法定量檢測試劑盒：規格為96T，美國GENMEDSCIENTIFICS INC產品，批號為20160601。

實驗氣體：醫用氧氣與高純度氮氣，濃度＞99.99%，由長春市醫巨洋氣體提供。

實驗儀器：低氧動物艙由本實驗室聯合長春市雨潤農業技術有限公司制作；大鼠轉棒疲勞儀型號為ZH-YLS-4C，安徽正華生物儀器設備有限公司產品；電子天平型號為YP1201N，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；可調高速勻漿器為FSH-2A型，江蘇省金壇縣望華科較儀器廠產品；賀利氏(Heraeus)臺式離心機Stratos型號Biofuge Stratos，德國賀利氏公司產品；紫外/可見分光光度計型號為Lambda25，美國Perkin Elmer公司產品。

實驗方法：①中藥的制作：調宗氣湯方藥物組成：黃芪，黨參，陳皮，法半夏，茯苓，白術，炙甘草，蘇子，萊菔子，地龍等。將上述中藥免煎提取物溶于83 mL的蒸餾水中備用。②實驗分組及給藥處理方法：實驗選取清潔級健康Wistar大鼠，雄性，體重220～250 g，10只，作為青年鼠對照組；實驗選取清潔級健康Wistar大鼠，雄性，體重350～400 g，50只，按體重隨機分為5組，每組10只動物，分別為老年鼠對照組、老年鼠模型組、中藥組、中藥+運動組、中藥+運動+吸氧組。青年鼠對照組、老年鼠對照組、老年鼠模型組動物給予1 mL/kg·d蒸餾水灌胃；中藥組動物給予23.33 g/kg·d中藥灌胃，該給藥劑量約為該藥物臨床每天使用等效劑量的2倍；中藥+運動組動物給予23.33 g/kg·d中藥灌胃后，強迫其于大鼠轉棒疲勞儀中運動30 min/d；中藥+運動+吸氧組動物給予23.33 g/kg·d中藥灌胃，強迫其于大鼠轉棒疲勞儀中運動30 min/d后，置于低氧動物艙吸純氧氣30 min/d。

慢性間歇性缺氧模型的建立(參照袁氏和Fletcher方法并改進[7])：①低氧動物艙的建立：用7 mm厚有機玻璃制成長方體艙，規格120 cm×60 cm×60 cm，上配可打開密封蓋，用于取放動物，側壁留一個小孔，直徑20 mm，用作輸入濃度99%氮氣，兩端分別安裝直徑160 mm的電動風閥各1個，其中一端安裝風機，用于缺氧艙內氣體排出及空氣吸入。試驗過程中將艙內水蒸氣和二氧化碳分別用硅膠干燥劑和生石灰吸收。②氣體控制通路：設計由單片機程序控制定時電磁轉換器、電動風閥及風機開關，控制氮氣輸入和空氣吸入，每個循環過程120 s，即充入60 s氮氣，隨后利用風機與電動風閥將艙內氣體排出并吸入60 s空氣。③慢性間歇性缺氧實驗：將老年鼠模型組、中藥組、中藥+運動組、中藥+運動+吸氧組大鼠分別置于慢性間歇性低氧艙內，緊閉艙門，循環充入氮氣和壓縮空氣。該循環每天重復8 h(8:30-16:30)，共持續5周。采用數字式測氧儀持續檢測慢性間歇性缺氧艙內FiO2，及時調節氣體流量，使每一循環過程中艙內最低FiO2達到5%～6%，隨后逐漸恢復至21%，以使大鼠平均動脈最低血氧飽和度在0.60～0.80。青年鼠對照組、老年鼠對照組大鼠常規飼養，不予任何處理。數字式測氧儀檢測結果為艙內FiO2在輸入氮氣后逐漸減低至5%～6%，持續約6～10 s，隨著壓縮空氣輸入，FiO2逐漸升至20%～21%。各組動物于造模當日起每日灌胃及處理1次，連續5周。

檢測指標：于5周末給藥30 min后，各組動物經20%烏來糖溶液(5 mL/kg)麻醉后處死。剖取大鼠頦舌肌組織，按每克頦舌肌組織加9 mL生理鹽水，制成10%組織勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上清勻漿液。嚴格按照鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒試劑說明書操作，采用比色法定量檢測其頦舌肌組織中鈣離子含量。準備5個1.5 mL的離心管，用緩沖液及標準液分別配制好0、0.5、1、2、4 mmol標準鈣濃度，用以繪制標準曲線。取出比色杯，加入20 μL的緩沖液與20 μL的反應液，然后加入20 μL的標準液或待測勻漿液，混勻后，室溫避光溫育5 min，于570 nm波長檢測其OD值。根據標準曲線計算出樣本中鈣離子含量。

結 果

“調宗氣”組方對慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響：實驗結果表明，老年鼠對照組動物與青年鼠對照組比較，頦舌肌鈣離子濃度極顯著性降低(P＜0.001)，證明隨著年齡的增長，頦舌肌逐漸松弛無力，與其中鈣離子濃度降低有關。老年鼠模型組動物與老年鼠對照組比較，頦舌肌鈣離子濃度極顯著性降低(P＜0.001)，證明間歇性缺氧會造成動物頦舌肌中鈣離子降低，導致頦舌肌松弛，模型復制成功。

中藥組動物頦舌肌鈣離子濃度與老年鼠模型組比較顯著性增加(P＜0.05)，中藥+運動組動物頦舌肌鈣離子濃度與老年鼠模型組比較極顯著性增加(P＜0.01)，中藥+運動+吸氧組動物頦舌肌鈣離子濃度與老年鼠模型組比較極顯著性增加(P＜0.001)，證明中藥、運動、吸氧對間歇性低氧模型動物頦舌肌鈣離子濃度均有改善作用，并以聯合應用的效果最為明顯，見表1。

表1 “調宗氣”組方對慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響(±s)

表1 “調宗氣”組方對慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響(±s)

注：與老年鼠模型組比較，?P＜0.05， ??P＜0.01，???P＜0.001。

討 論

目前已證實許多危險因素參與OSAHS的發病和進展，其中以頦舌肌為主的上氣道擴張肌結構和功能障礙被認為是OSAHS的主要致病因素之一。擴張肌中的頦舌肌是上氣道中最大也是最主要的擴張肌，被稱為上氣道的“安全肌”。清醒狀態下，OSAHS患者頦舌肌的活動達到其最大活動能力的40%，遠較正常人12%的水平高，提示為了維持上氣道開放，其上氣道肌肉活動代償性增強[8]。可以假設，如果沒有代償性活動，清醒時即有可能出現上氣道阻力明顯增高，甚至發生呼吸暫停。在睡眠時，阻塞性睡眠呼吸暫停患者上氣道肌肉活動變化明顯不同于正常人，睡眠開始，可見頦舌肌的吸氣時相性活動減弱，其他擴張肌張力性活動也降低，對吸氣負壓增加的反射性代償活動消失，不能對抗胸腹部呼吸肌產生的吸氣負壓而發生OSAHS[9-13]。Pierce等的研究發現OSAHS患者上氣道陷閉以及氣流阻力的增加與頦舌肌功能障礙密切相關[14]。

胞質內鈣離子濃度直接影響骨骼肌收縮和松弛，進而引起咽部肌肉組織形態結構的改變，導致阻塞程度的加重或減輕。人體的多種運動都是由骨骼肌的收縮功能實現的，骨骼肌細胞的興奮-收縮耦聯機制是骨骼肌收縮的基礎。胞質鈣離子作為細胞內廣泛的第二信使，在肌細胞的興奮-收縮耦聯過程中發揮重要作用。

本課題研究結果表明了“調宗氣”組方對大鼠頦舌肌成肌細胞胞質內鈣離子濃度有著顯著的影響，在維持細胞內鈣離子穩態過程中發揮重要作用，其維持肌細胞活性，從而減少肌肉的疲勞松弛與損傷。

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