Vero細胞微載體懸浮培養生產工藝研究

王景慶 游松 張微

（沈陽藥科大學 遼寧 沈陽 110016）

動物細胞的體外培養已經廣泛應用于藥品特別是疫苗的生產中，通過生物反應器對Vero細胞和病毒進行大規模、高密度培養，并通過此方式進一步生產狂犬、乙腦等疫苗在國內已經為主流技術[1]。Vero細胞是一種典型的貼壁依賴性動物細胞，其生長、擴增繁殖需要有足夠大的表面積，球狀微載體懸浮培養這一技術平臺很好的解決了以上的限制因素。因為很多種類的病毒（如狂犬病毒等）都是通過細胞表面吸附這一途徑，進入到細胞中，然后利用細胞中的有效物質來繁殖。所以Vero細胞的大規模、高密度培養是生產過程中相當關鍵的一個步驟。本文重點是通過優化并更加合理的設置生物反應器的運行參數，以達到更良好的生產條件。

表1 細胞培養情況表

表2 細胞培養情況表

1.材料與方法

1.1 主要材料

138-143代Vero細胞（美國ATCC），M199和DME培養基，細胞培養時加5% 新生牛血清，微載體為Cytodex1[2，3]。

1.2 主要儀器

生物反應器為美國EPPENDORF公司CelliGen510型生物反應器（40L），倒置顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 Vero細胞的復蘇準備：取第138代細胞，37℃乙醇浴融化；接種細胞到含有10%牛血清培養液的細胞瓶中，37℃培養；6～24小時后更換10%牛血清培養液；細胞代次為139代。

1.3.2 細胞培養：37℃、10%牛血清培養液培養，三次擴增達到可以進行生物反應器培養的細胞數量。

1.3.3 微載體的準備：按照15～20g/L生物反應器體積的比例稱量微載體，用PBS溶液浸泡并121℃濕熱滅菌60分鐘；滅菌后的微載體用培養液進行平衡，室溫浸泡72小時后使用。

1.3.4 生物反應器的準備：正確安裝培養液流加管、攪拌漿、沉降柱等配件；向生物反應器內加入注射用水，密封生物反應器并檢測氣密性。氣密性合格后在位濕熱滅菌121℃40分鐘；校正DO電極。

1.3.5 生物反應器細胞接種：觀察轉瓶內第142代細胞生長狀態，匯合率達到100%時用0.25%胰酶消化上述細胞，制成細胞懸液；收集的細胞懸液混合于微載體容器中，再無菌連接到生物反應器，正壓將細胞接種到生物反應器內。

1.3.6 生物反應器內細胞培養與正常生產的參數設置：40L反應器設定參數：溫度37℃、轉數38rpm、溶氧值（DO）15、pH值7.4、通氣量0.1～8.0。

2.結果

2.1 生物反應器不同轉數的持續培養對Vero細胞生長的影響，見表1。

2.2 生物反應器非正常轉數對Vero細胞生長的影響，見表2。

3.討論

微載體懸浮培養Vero細胞的生產工藝已應用到很多疫苗生產企業，這個技術平臺通過微載體對動物細胞進行高密度的培養可以達到很好的規模效應。本次實驗所用的是美國EPPENDORF公司生產的CelliGen510 型生物反應器，其是最新一代的生物反應器動物細胞培養平臺，以往生產的生物反應器體積多為5L、7.5L、30L，本次實驗所用CelliGen510 型生物反應器體積更大（40L），所以有著更好的經濟效益。

通過生物反應器進行對Vero細胞和病毒進行大規模、高密度培養并通過此方式進一步生產相關疫苗，這一工藝雖然已應用到生產中去，但其整個工藝過程時間比較長（狂犬疫苗生物反應器連續運行過程達到20天，出血熱疫苗等品種更長），設備出現異常的概率相對較高。特別是生物反應器的攪拌系統，長時間的工作容易出現轉速波動等情況。高轉數的發生會提高系統的剪切力從而導致細胞損傷（動物細胞易受剪切力損傷），而低轉數會引起微載體沉積并使細胞無法生長，但細胞本身也有一定的耐受力，轉數在一定范圍內波動所引起的微小傷害可以恢復，且對細胞培養過程沒有太大的影響。通過數據可知，一定范圍內的轉數對細胞影響不是很大，但超過一定區間會有影響。短時間內的轉數波動在一定范圍內細胞有一定的耐受力，但超過一定的范圍會對細胞產生不可逆轉的傷害。

本次實驗中考察了生產過程中的轉速波動對微載體懸浮培養Vero細胞的影響，對于提高生產效率有十分重要的借鑒作用。

[1]查力，高軍，侯劍英，白珠穆，袁德明，楊俊偉，等.生物反應器細胞培養制備人用狂犬病疫苗中國生物制品學雜志，2006,19(3):288-290.

[2]CytidexTM 1: B eaded m icrocarriers for cell cu ltu re, Pharm acia FineChem icals, Technical Book let Seriw s,Uppsala, Sw eden 1978.

[3]VanW ezelAL. M icricarrier cu ltu res of an im al cells.In:K ruse PF,PatterssonMK, ed s. Tissu e cu ltu re: metbods and app lications. NewYork: A cadem ic Press,1973.372-377.