TLR9-mRNA的表達與急性胰腺炎病人炎性因子變化的相關性研究

楊宏達 劉志

TLR9-mRNA的表達與急性胰腺炎病人炎性因子變化的相關性研究

楊宏達 劉志

目的探討單核巨噬細胞TLR9-mTLR9-mRNA的表達與急性胰腺炎(AP)病人炎性因子變化的相關性。方法24小時內被診斷為AP的病人40例，分別于第1，3，5天采集病人的EDTAK2抗凝靜脈血，并檢測胰彈性蛋白酶、促炎細胞因子和抗炎細胞因子。分離外周血單個核細胞，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應對TLR9-mRNA進行檢測，分析其5天內表達變化規律。結果所有AP病人在第 1天、第3天、5天時單核巨噬細胞 TLR9-mRNA對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。AP病人外周血單核巨噬細胞TLR9-mRNA的改變與胰彈性蛋白酶、促炎細胞因子呈明顯正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。結論外周血單核巨噬細胞TLR9-mRNA的表達改變與AP病人炎性因子(胰彈性蛋白酶、促炎細胞因子)表達上調有相關性，TLR9可能介導AP的發生與發展。

急性胰腺炎； 胰彈性蛋白酶； 促炎細胞因子； 抗炎細胞因子； 單核巨噬細胞TLR9-mRNA

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由于多種原因導致胰酶被激活，而引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應，以血、尿淀粉酶增高為主要表現[1]。臨床上常表現為腹痛、嘔吐、發熱等癥狀[2]。臨床上根據預后分型，預后良好者為輕型急性胰腺炎；預后不良、發生胰腺出血壞死，并繼發感染、腹膜炎，甚至休克者為重型急性胰腺炎。統計顯示，AP發病率不斷上升，治療效果不理想，主要是因為目前研究尚未明確AP的發生、發展機制，以及未能認識疾病發生的始動環節以及分子生物學基礎[3]。在AP分子生物學機制的研究中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)已成為備受關注的一種哺乳動物細胞表面信號傳導跨膜蛋白，它在炎性反應的發生過程中起著重要的介導作用[4]，其中，TLR9是TLRs中的一種重要受體，它主要通過識別外源性的非甲基化CpG基序來啟動炎癥的鏈性反應[5]。我們對單核巨噬細胞TLR9-mRNA的表達與急性胰腺炎病人炎性因子變化的相關性進行探討。

對象與方法

一、對象

2016年2月～2016年9月本院急診科于24小時內診斷為AP的病人40例，男性23例，女性17例，平均年齡(52.32±3.21)歲。入院時的40例病人為對照組，實驗組按時間分組，分為第1天組、第3天組和第5天組。納入標準：年齡≤60歲；臨床確診為AP；無其它嚴重系統性疾病。排除標準：臨床未診斷為AP；伴有其它系統嚴重性疾病；不愿參加本次研究者。所有AP病人年齡、性別和病情等基本資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

二、方法

分別采用人淋巴細胞分離液、Ficoll Taq DNA聚合酶、Trizol試劑和Rever Tra Ace逆轉錄酶。所有AP病人分別于第1、3、5天采集靜脈血，EDTAK2抗凝，并檢測其胰彈性蛋白酶、促炎細胞因子和抗炎細胞因子。分離外周血單個核細胞，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應對TLR9-mRNA進行檢測，分析其表達規律。

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照半定量，各樣本表達強度由各樣本灰度值/GAPDH灰度值計算所得。利用自動生化儀測定淀粉酶和脂肪酶含量，利用全自動定量繪圖標儀測量細胞因子含量。

三、統計學處理

結 果

1.對照組與第1、3、5天時的單核巨噬細胞TLR9mRNA表達含量比較：所有AP病人在第1天、第3天、5天時單核巨噬細胞TLR9mRNA與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。說明單核巨噬細胞TLR9在AP炎癥反應過程中起著重要的作用，也就能間接推測AP能誘導單核巨噬細胞TLR9的強烈表達。

2.對照組與第1、3、5天時的淀粉酶與脂肪酶含量比較：在第1天、第3天時的淀粉酶、脂肪酶含量與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；第5天時的淀粉酶、脂肪酶含量與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。AP病人的淀粉酶、脂肪酶與胰腺的自身免疫反應有關，單核巨噬細胞TLR9的高表達可能介導炎癥反應。見表1。

表1 對照組在入院時與第1、3、5天時的淀粉酶、脂肪酶含量比較

注：與對照組比較，aP<0.05

3.比較對照組與第1、3、5天時的細胞因子檢測結果：第3天和第5天時，細胞因子TNF-α、IL-1含量與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。第1 天時IL-4含量與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，這說明在AP病人前一周內單核巨噬細胞TLR9mRNA的表達變化與炎性因子有一定相關性，單核巨噬細胞TLR9mRNA是AP炎癥反應中的介導因子。見表2。

表2 對照組在入院時與第1、3、5天時的細胞因子檢測結果關系比較

注：與對照組比較，aP<0.05

討 論

AP在我國該病發病率不斷上升，病死率高，目前尚未明確該疾病發生和發展的分子生物學機制[6-7]。有報道發現，TLR9的高水平表達在免疫反應中發揮著重要作用，它可能通過識別外源性的非甲基化CpG基序來啟動炎癥的鏈性反應[8-9]。TLR9作為一類新的哺乳動物細胞表面信號傳導跨膜蛋白，主要表達于B細胞、樹突細胞等免疫細胞，甚至在非免疫細胞或腫瘤細胞上也有高水平表達[10]。

有研究發現，在大鼠的胰腺組織中，采用免疫組化方法發現TLR9主要表達在胰管上皮細胞[11]。一種被廣泛認可的觀點是胰管黏膜屏障是胰腺自我保護機制，是一種物理性的機械隔離機制，也是一種化學性保護機制[12]。單核巨噬細胞TLR9作為先天性免疫系統的重要一員，它可能在參與到胰管黏膜屏障的抗炎調節中，并與釋放的其它細胞因子、促炎性因子等起調節作用，單核巨噬細胞TLR9也可能是免疫反應中一個潛在的調節點[13]。另有研究表明，單核巨噬細胞TLR9參與了AP病人早期炎癥反應的血管微循環損害，同時發現人類AP能夠誘導TRL9mRNA快速而強烈地表達[14]。

有研究發現，在人外周血單核細胞中，TLR9-mRNA呈現低水平的表達，但其在早期AP時的水平顯著升高。所有AP病人的單核巨噬細胞TLR9在第1天時相對于對照組上調8.12倍，差異有統計學意義。在第3、5天時相對于對照組緩慢上調，其中，在第5天時上調至峰值，分別相對于對照組上調9.01倍和9.52倍，差異有統計學意義[14]。上述研究表明，TLR9對AP反應敏感，可短時間內呈現快速升高的趨勢，可進一步推斷其在AP疾病的發生、發展過程中可能起到顯著的作用。有研究表明，CpG并不能夠誘導單核巨噬細胞TLR9表達上調，但AP病人的炎癥反應可以促使單核巨噬細胞TLR9表達上調[14]。說明單核巨噬細胞TLR9在AP炎癥反應過程中起著重要作用，也就能間接推測AP能誘導單核巨噬細胞TLR9的表達。本研究通過逆轉錄聚合酶鏈式反應對TLR9-mRNA的表達進行檢測，結果發現，第1天時、第3天時淀粉酶、脂肪酶含量與對照組比較差異有統計學意義；第5天時，淀粉酶、脂肪酶含量接近于基準水平值，與對照組差異無統計學意義。該結果表明，AP病人的淀粉酶與脂肪酶與胰腺的自身免疫反應有關，單核巨噬細胞TLR9的高表達可能介導本次炎癥反應。單核巨噬細胞TLR9表達水平的升高與血清中的部分細胞因子增加存在顯著關系。此外，既往研究指出，TLR9好激活能夠大量釋放IL-6、IL-10、IL-1、IL-12及TNF-α等促炎癥細胞因子[15]。本研究發現，第3天和第5天時，細胞因子TNF-α與IL-1含量與對照組比較差異有統計學意義。第1天時IL-4含量與對照組比較差異有統計學意義。本研究發現，在AP病人前5天內的細胞因子檢測中，雖然細胞因子TNF-α與IL-1在炎癥過程中，隨著時間不斷上調，單核巨噬細胞TLR9mRNA的表達水平也不斷升高，但IL-4沒有隨著單核巨噬細胞TLR9mRNA的表達水平的升高而持續上調。結果說明，單核巨噬細胞TLR9mRNA在AP病人炎癥反應過程中起主要介導作用，淀粉酶與脂肪酶在逐漸降低的時候，單核巨噬細胞TLR9mRNA表達水平仍在升高，細胞因子IL-4逐漸降低時，單核巨噬細胞TLR9mRNA表達水平仍在升高。這說明在AP病人前一周內單核巨噬細胞TLR9mRNA的表達變化與炎性因子有一定相關性，單核巨噬細胞TLR9mRNA是AP炎癥反應中的介導因子，或者只是AP發生、發展過程中的一種單純的促炎性因子介質，可能與疾病的預后和病情嚴重程度有一定關系。

在AP病人前一周內單核巨噬細胞TLR9mRNA的表達變化與炎性因子有一定相關性，單核巨噬細胞TLR9mRNA在AP病人炎癥反應過程中起重要的介導因子作用。

[1] 桂海波，陳雪梅.高三酰甘油血癥性急性胰腺炎的研究新進展[J].醫學綜述，2016，22(21)：4245-4249.

[2] Hua Z，Su Y，Huang X，et al.Analysis of risk factors related to gastrointestinal fistula in patients with severe acute pancreatitis：a retrospective study of 344 cases in a single Chinese center[J].BMC Gastroenterol，2017，17(1)：29.

[3] 楊寧，郝建宇，張冬磊.高脂血癥性和膽源性急性胰腺炎患者血鈣和全段甲狀旁腺素的變化及其與病情的相關性[J].中華胰腺病雜志，2015，15(5)：302-305.

[4] 姚建輝，范震.急性胰腺炎反應期C反應蛋白測定對病情嚴重程度的評估[J].昆明醫科大學學報，2015，36(10)：107-110.

[5] Mirhashemi S，Soori M，Faghih G，et al.Scrotal Abscess：A Rare Presentation of Complicated Necrotizing Pancreatitis[J].Arch Iran Med，2017，20(2)：124-127.

[6] 李盛，胡炎軍，朱求實.急性胰腺炎病人血小板平均容積測定的意義[J].腹部外科，2015，28(5)：363-366.

[7] Haddad JD.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：597.

[8] ChE F，Vege SS，Wilcox CM.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：598-599.

[9] 劉圓圓，江邁紅，戴光榮.高脂血癥性急性胰腺炎和膽源性急性胰腺炎臨床特征分析[J].臨床急診雜志，2013，44(12)：976-979.

[10] 尼瑪旦周，措羊.中度急性胰腺炎臨床特征分析[J].肝膽胰外科雜志，2014，26(4)：285-288.

[11] 羅旭，葉勁松，梁昭.BISAP評分對急性胰腺炎嚴重程度的預測價值研究[J].養生保健指南，2016，(17)：172-173.

[12] 江帆，黎建軍，吳國俊，等.急性重癥胰腺炎患者早期腸內外營養支持的效果評價[J].臨床急診雜志，2013，14(12)：578-579.

[13] Rijkers AP，van Eijck CH.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：596-597.

[14] Donnelly PE，Winch DE.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：597.

[15] Johnson JR.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：598.

Studyontherelationshipbetweentheexpressionoftoll-likereceptor9-mRNAandinflammatoryfactorsinpatientswithacutepancreatitis

YANGHongda，LIUZhi.

(DepartmentofEmergency，theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of Toll-like receptor 9(TLR9)-mRNA and inflammatory factors in patients with acute pancreatitis(AP).MethodsA total of 40 patients with AP diagnosed in our hospital from February 2016 to September 2016 in 24 h were enrolled.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected on day 1，3，5.And pancreatic elastase，proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines were detected.Peripheral blood monouclear cells were isolated and the mRNA expression of TLR9 was tested by polymerase chain reaction.The change of TLR9-mRNA in 5 days was analyzed.ResultsThe level of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with AP at 1，3，5 days were significantly higher than that in the control group，and the difference was statistically significant(P<0.05).Changes of the TLR9-mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with AP was positively correlated with the levels of pancreatic elastase and proinflammatory cytokines，and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear macrophages was closely related to the up-regulation of inflammatory cytokines in AP patients，suggesting that TLR9 may mediate the occurrence and development of AP.To investigate the correlation between the expression of TLR9-mTLR9-mRNA and inflammatory factors in patients with AP.MethodsA total of 40 patients with AP diagnosed in our hospital from February 2016 to September 2016 in 24h were selected.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected on day 1，3，5.And Pancreatic elastase，proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines were also detected.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected，tested the above indicators and used them as the benchmark level of the corresponding indicators.ResultsThe levels of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with AP at 1，3，5 days were significantly higher than in the control group，and the difference was statistically significant(P<0.05).Changes of TLR9-mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with AP was positively correlated with pancreatic elastase and proinflammatory cytokine，and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear macrophages was closely related to the up regulation of inflammatory cytokines in AP patients，suggesting that TLR9 may mediate the occurrence and development of AP.

acute pancreatitis； pancreatic elastase； proinflammatory cytokines； inflammatory cytokine； macrophage TLR9-mRNA

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.12.013

110001 沈陽，中國醫科大學附屬第一醫院急診科

劉志，Email：39050206@qq.com

2017-04-01)

楊澤平)