原發性腎病綜合征患兒腎組織P-gp170蛋白和mRNA表達與臨床病理及預后的關系

劉廣濤 關鳳軍 董 晨

摘? ?要：目的? 觀察原發性腎病綜合征患兒腎組織中P-糖蛋白170的表達，分析腎組織中P-gp170表達與臨床和病理的關系，探討P-gp170表達在PNS 患兒GC耐藥中的作用。方法? 采用腎活檢術取得96例處于不同病程的PNS患兒腎組織標本，進行常規病理學診斷和腎臟病理定量分析;應用免疫組織化學及原位雜交法分別檢測PNS患兒腎組織中P-gp170蛋白及mRNA的表達，比較不同腎臟病理類型及病理積分患兒P-gp170的表達;比較未用GC與應用GC后PNS患兒腎組織P-gp170的表達。結果? ①正常腎臟即有一定量的P-gp170表達;未用GC組即高于正常對照，差異有統計學意義（P<0.05）;②病理積分較高者P-gp170表達陽性量高于病理積分低者，差異有統計學意義（P<0.05）;不同病理類型P-gp170的表達有差異，局灶節段硬化（FSGS）、膜性腎病（MN）和硬化性腎病（SGN）表達較高，組間比較差異無統計學意義（P>0.05），微小病變（MCD）和系膜增生型（MsPGN）者表達較低，兩者比較差異無統計學意義（P>0.05）;而前三者與后兩者差異有統計學意義（P<0.05）;③未用GC者較應用GC后的PNS患兒腎組織P-gp170表達量低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? P-gp170在PNS患兒腎組織的表達可能與腎病病損有關，可結合病理類型和病理損傷程度同時檢測腎組織P-gp170預測不同患兒GC反應性; P-gp170的表達增高可能與PNS活動和復發有關，可作為臨床預測預后的指標。

關鍵詞：腎病綜合征;P-糖蛋白170;糖皮質激素;耐藥;兒童

中圖分類號：R726.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.21.017

文章編號：1006-1959（2018）21-0061-05

Relationship between the Expression of p-gp170 Protein and mRNA in Renal Tissue of Children with Primary Nephrotic Syndrome and Clinical Pathology and Prognosis

LIU Guang-tao1，GUAN Feng-jun2，DONG Chen2

（1.Department of Pediatrics，the First People's Hospital，Changzhou 213000，Jiangsu，China;

2.Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract：Objective? To observe the expression of P-glycoprotein 170 in renal tissues of children with primary nephrotic syndrome， and to analyze the relationship between P-gp170 expression and clinical and pathological changes in renal tissues， and to investigate the expression of P-gp170 in GC-resistant children with PNS effect. Methods? Renal tissue samples from 96 children with PNS in different stages of disease were obtained by renal biopsy. The routine pathological diagnosis and quantitative analysis of renal pathology were performed.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detect the expression of P-gp170 protein and mRNA in renal tissues of children with PNS， and the expression of P-gp170 in different renal pathological types and pathological scores were compared.The expression of P-gp170 in renal tissue of children with PNS after GC and GC application was compared.Results? ①There was a certain amount of P-gp170 expression in normal kidney，The GC group was significantly higher than the normal control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.②The positive expression of P-gp170 was higher than the pathological score，the difference was statistically significant （P<0.05）.The expression of P-gp170 was different in different pathological types. The expressions of focal segmental sclerosis （FSGS）， membranous nephropathy （MN） and sclerosing nephropathy （SGN） were higher. There was no significant difference between the two groups （P>0.05）. The expressions of microscopic lesions （MCD） and mesangial proliferative （MsPGN） were lower，the difference was not statistically significant （P>0.05）. The difference between the first three and the latter two was statistically significant （P<0.05）.③The expression of P-gp170 in renal tissue of children with NS after GC was lower than that of patients with GC， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? The expression of P-gp170 in renal tissue of PNS children may be related to nephropathy. Renal P-gp170 can be combined with pathological type and degree of pathological injury to predict GC reactivity in different children. The increased expression of P-gp170 may be related to the activity and recurrence of PNS， and can be used as a predictor of prognosis.

Key words：Neph rotic syndrome;P-glycoprotein 170;Glucocorticoid;Drug resistance;Children

原發性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童時期較為常見的一種腎臟疾病，其主要治療藥物為糖皮質激素（glucocorticoid，GC），研究表明[1]，同一病理改變的不同腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）患兒對GC反應不同，不同病理類型對GC反應存在顯著差異。而初始GC不足的患兒往往后來表現對GC不敏感，另有一部分最初對GC敏感，GC應用一段時間后，出現對GC抵抗，或反復復發。我們前期研究發現[2]，GC敏感和GC耐藥PNS患兒腎組織存在P-糖蛋白170（P-glycoprotein170，P-gp170）表達的差異，GC 耐藥PNS患兒存在腎臟原位P-gp170的過度表達，推測P-gp170腎組織的表達異常可能是一個新的病理生理環節，參與了PNS的GC耐藥的發生。本研究分析P-gp170的表達與臨床GC反應性指標間的關系，旨在揭示PNS耐藥發生機制。

1資料與方法

1.1一般資料? 選擇2013年1月～2015年6月在常州市第一人民醫院兒科住院的符合原發性NS診斷標準的患兒96例，男57例，女39例，年齡2～12歲，平均年齡（7.48±0.63）歲，無陽性家族史。本研究經我院經倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。依據腎穿刺的時間將病例分為：未用GC治療者;GC應用半年內未復發者;反復復發，病程一年內者;隨訪時間1年。對照組腎組織為在我院泌尿外科住院的10例因外傷腎切除的組織，對照組患兒男6例，女4例，年齡6歲5個月～12歲9個月，平均年齡（9.62±0.78）歲，這些患兒既往無腎臟疾病病史;血壓、血常規、尿常規及肝腎功能均正常;取腎組織前4周無感染、過敏性疾病、服藥史;肉眼和光學顯微鏡下觀察腎組織無病理學異常改變。PNS患兒與對照組的年齡、性別比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2觀察指標

1.2.1病理指標? 包括腎臟病理類型及腎臟病理積分及腎組織P-gp170蛋白及mRNA的表達。其中腎小球病理評分標準為：①系膜細胞增殖：按無、輕、中、重度增殖分別記0，1，2和3分。②基質增寬：正常，記0分;輕度變化呈節段性增寬，毛細血管袢無明顯影響，記1分;中度變化呈彌漫性增寬，<50%毛細血管袢狹窄閉鎖，記2分;重度變化呈彌漫性增寬，>50%毛細血管袢狹窄閉鎖，記3分。③硬化改變：正常，記0分;局灶節段分布，硬化腎小球<30%，記1分;硬化腎小球>30%～60%，記2分 ;硬化腎小球>60%，記3分。④新月體或纖維形成：正常（無形成），記0分;呈局灶節段分布<25%，記1分;彌漫性節段分布25%～50%，記2分;彌漫性灶性分布>50%，記3分。

1.2.2臨床觀察指標? 應用GC者均為初始口服強的松2 mg/（kg·d），按正規療程減量。

1.3主要試劑? P-gp170鼠抗人單克隆抗體（Sigma公司，批號200601）;免疫組化試劑盒（Sigma公司，批號2005BA0131）;多藥耐藥基因原位雜交檢測試劑盒（MDR ISH Detection Kit）， 產品目錄號：MK1153，針對人MDR1靶基因的mRNA序列為：①5'-ATGCT GGTGT TCGGA TACAT GACAG ATAGT TTTAC-3';②5'-CTGCC TATGA? AATCT TCAAG? ATAAT TGATA ATGAG-3';③5'-TGCTG CTTGT TTCCG GTTCG GTGCC TACTT GGTGG-3'。

1.4方法和步驟

1.4.1腎組織常規染色? 腎組織取出后，進行免疫組化檢測和常規染色，電鏡檢查由電鏡室報告檢驗結果。2周內進行雜交實驗，按照說明書進行。

1.4.2腎組織免疫組化測定? 腎組織石蠟切片，脫蠟，脫水，滅活，蒸餾水洗滌，修復抗原，蛋白酶K消化，PBS洗滌，封閉，加一抗（1∶100），4 ℃過夜，同時做陰性對照。PBS洗滌，加二抗，37 ℃放置30 min。PBS洗滌，滴加鏈親和素-過氧化酶溶液，37 ℃孵育，PBS洗滌，DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染，脫水，透明，封片。

1.4.3腎組織原位雜交測定p-gp170mRNA表達? 室溫處理玻片，蒸餾水洗滌，胃蛋白酶，37 ℃消化。原位雜交用 PBS洗滌，后固定，預雜交，雜交：按每張切片20 μl雜交液，雜交后過夜，洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，原位雜交用PBS洗滌，滴加SABC，PBS洗滌。滴加生物素化過氧化物酶，PBS洗滌，DAB顯色，脫水，二甲苯透明，封片。

1.4.4腎病理定量分析方法? 按中南大學湘雅二院小兒腎臟病研究室吳小川等[3]所制定的小兒紫癜性腎炎病理定量分析方法進行，分別對腎小球與腎小管-間質的病理改變進行半定量評分。

1.4.5免疫組化及原位雜交結果觀測? 在光學顯微鏡下以及應用IBAS2000圖像分析系統（德國OPTON公司）對免疫反應物進行觀察，測定每個觀察視野（×100）A 區域（腎小球、腎小管和間質）的輝度（GA）、陽性產物α相的輝度（Gα）及面積密度（AAα），按公式計算觀察視野中的P-gp170陽性單位（PU）值。PU=100×∣Gα-GA∣/[（1-AAα）·Gmax]，其中Gmax為儀器的最大輝度值。

1.5統計學分析? 采用SPSS 13.0軟件進行分析，所有資料均采用（x±s）表示;所有數據分析之前都進行方差齊性檢驗。多組資料間和同組多個時點資料間比較，方差齊者，采用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊者，采用Kruskal-Wallis分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney法，各參數間的相關性分析采用Mann-Whitney線性相關及Spearman等級相關分析;以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01 為統計學意義顯著。

2結果

2.1各組腎組織中P-gp170的表達特點? 對照組腎小球固有細胞無陽性信號，腎小管和腎間質均有P-gp170mRNA和蛋白的表達;PNS各組患兒P-gp170的表達分布與正常對照基本相同，但各部位陽性信號明顯高于對照，差異有統計學意義（P<0.05）;初發未用GC者、初發應用GC治療半年未復發者、反復復發<12個月者各組比較，未用GC與其它各組比，差異有統計學意義（P<0.05）;應用GC 兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表1～表4。

2.2不同腎臟病理積分P-gp170表達比較? 腎臟病理積分較高者P-gp170表達陽性率較病理積分低者增多，差異有統計學意義（P<0.05），腎小管間質損害重者P-gp170的表達量增高，差異有統計學意義（P<0.05），見表1～表3。

2.3不同腎臟病理類型P-gp170表達比較? 反復復發者不同病理類型P-gp170的表達有差異，局灶節段硬化和膜性腎病、硬化性腎炎表達較高，微小病變腎病和系膜增生性表達最低，前三者與后兩者比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

3討論

PNS的GC耐藥是涉及多因素、多步驟的病理過程，GC的反應性影響著PNS的轉歸。臨床研究發現[4]，腎臟病理組織學不同，對GC的反應往往不同;此外，治療方式也與GC耐藥有關[5]。近年研究發現MDR1基因和P-gp170與多種臨床和病理指標密切相關[6]。GC的應用可影響P-gp170的表達，進而影響GC的療效[7]。

本實驗中發現，P-gp170在正常人腎臟組織中即有一定量的表達，而PNS患兒腎組織P-gp170的表達增高，提示該因子表達異常可能與腎臟病變有關。以往有學者在白血病的研究[8]中得出了類似的結論：某些P-gp170高表達患者在化療前已存在原發耐藥，對化療不敏感，療效較差，故P-gp170可作為白血病預測預后的指標。我們認為，這部分患兒GC治療前即有P-gp170表達增高，說明他們本身即可能存在原發GC耐藥。P-gp170是人類MDR1基因產物，MDR1是與多藥耐藥相關的最重要基因，亦證實NS腎組織細胞具有內源性 MDR1 特性，存在一定的天然耐藥性。因此，檢測病人的MDR1可能為臨床提供一個有意義的指標。

本研究發現，不同病理類型P-gp170表達存在差異，因而我們推測，PNS患兒腎活檢同時若行P-gp170的檢測，P-gp170表達量的高低可反映GC的療效，低表達的病理類型對GC治療敏感;反之，高表達者對GC治療抵抗。這與病理類型表現為微小病變型和系膜增生型腎小球腎炎的患兒對GC的療效優于膜性腎病、硬化性腎病的臨床結果相似[9]。但本實驗選擇的病例數較少，尤其是硬化型者較少，故本實驗的結果尚有待于進一步證實。而病理積分與P-gp170表達的關系表明病理損傷越重，P-gp170表達水平越高，GC耐藥的幾率增加。故我們推測P-gp170表達水平與病理損傷的程度有某種關聯，可能由于病理損傷致P-gp170表達進一步增高，也可能由于炎癥介質表達增多而促進了P-gp170表達增多，從而介導耐藥。

研究表明[10]，耐藥的產生可以出現在治療前，稱為原發性耐藥或內在性耐藥;也可以在治療過程中逐漸出現或復發后出現，稱為獲得性耐藥或繼發性耐藥，本研究結果與上述多種疾病的耐藥背景相似。因此我們推測，MDR1基因及表達產物與GC互相作用，相互拮抗在PNS繼發耐藥中發揮了重要的作用。P-gp170的高表達可導致病人GC耐藥，GC用量引發了P-gp170的表達改變，從而導致GC耐藥;因而，監測P-gp170的表達變化有助于對患者GC療效的判斷。

綜上所述，P-gp170在PNS患兒腎組織的表達與腎病病損有關，可結合病理類型和病理損傷程度同時檢測腎組織P-gp170來預測不同患兒GC反應性; P-gp170的表達增高可能與NS活動和復發有關，可作為臨床預測預后的指標。

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