水飛薊素對(duì)乳腺癌MCF-7/DOX細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制研究

吳聰沖 吳青青 喻夏昕 馬芳笑 毛丹漪 劉曉谷?

·論著·

水飛薊素對(duì)乳腺癌MCF-7/DOX細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制研究

吳聰沖 吳青青 喻夏昕 馬芳笑 毛丹漪 劉曉谷?

目的 探討中藥單體水飛薊素（Sily）對(duì)人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制。方法 （1）用MTS比色法測(cè)定阿霉素（DOX）對(duì)MCF-7/S 和MCF-7/DOX 的毒性作用，計(jì)算耐藥倍數(shù)；加入Sily干預(yù)后與陽(yáng)性藥物對(duì)照組（Ver組）比較，評(píng)估Sily的逆轉(zhuǎn)療效。（2）用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）及免疫印跡（Western-blot）法分別檢測(cè)Sily、Ver處理后，MCF-7與MCF-7/DOX細(xì)胞中多藥耐藥基因MDR1 mRNA及其產(chǎn)物 P-gp的變化。結(jié)果 （1）DOX對(duì)敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1.868μg/ml和60.625μg/ml，耐藥倍數(shù)為32.45倍，Sily10μg/ml（存活率＞98%）作用于MCF-7/DOX 48h后，耐藥細(xì)胞株的IC50降至12.757μg/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為4.75倍（P＜0.01）；（2）在Sily（10μg/ml）作用下，MDR1 mRNA及其編碼的蛋白P-gp表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論 無(wú)細(xì)胞毒性劑量的水飛薊素能夠逆轉(zhuǎn)MCF-7/DOX對(duì)DOX的耐藥性，其逆轉(zhuǎn)作用可能與下調(diào)MDR1 mRNA及其編碼的蛋白P-gp的表達(dá)有關(guān)。

乳腺癌 水飛薊素 P-糖蛋白 逆轉(zhuǎn)耐藥

Objective To investigate the reversal effect and mechanism of the traditional medicine monomer silymarin（Sily）on the drug resistance of human breast cancer cell MCF-7/DOX. Methods （1）MTS assay was adopted to determine the toxic effects of doxorubicin（DOX）on MCF-7/S and MCF-7/DOX，the multiple of drug resistance was calculated. When Sily was combined，the reversal effect with Verapamil（Ver）was evaluated as a positive control.（2）To test the changes of multidrug resistance gene MDR1 mRNA and its products P-gp after being treated with Sily and Ver by means of real-time PCR（RT-PCR）and western-blot respectively. Results （1）The IC50value of sensitive cell and resistant cell with DOX were 1.868μg/ml and 60.6μg/ml respectively，the multiple of drug resistance was 32.45 times. The IC50value of MCF-7/DOX declined to 12.757μg/ml and the reversal index was 4.75 times（P＜0.01）after the effect of Sily（10μg/ml）with a more than 98 percent survival rate，which was detected after 48 hours.（2）The expression level of MRD1 mRNA and the encoded proteins P-gp had signif i cantly decreased（P＜0.01）.Conclusions Noncytotoxic dose of Sily can reverse the DOX resistance of MCF-7/DOX，and the reversal effect is associated with the down-regulation of MRD1 mRNA and the expression of the encoded proteins P-gp.

Breast cancer Silymarin P-glycoprotein Drug resistance inversion

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)2012年全球癌癥報(bào)告數(shù)據(jù)顯示［1］，全球每年新發(fā)乳腺癌病例約167.1萬(wàn)，死亡人數(shù)每年達(dá)52.2萬(wàn)，且呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)中國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)［2］，2015年中國(guó)乳腺癌新增患病人數(shù)已達(dá)26.86萬(wàn)人。乳腺癌作為實(shí)體瘤中化療效果最佳的腫瘤之一，化療在整個(gè)治療中占重要地位，但多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象的產(chǎn)生，降低較多抗癌藥物（如阿霉素等）的臨床療效，成為乳腺癌化療的失敗主要原因。MDR發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，臨床上解決MDR的方法之一是使用逆轉(zhuǎn)劑，尋找高效低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)。2016年5月至2017年3月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討中藥水飛薊素（Silymarin）對(duì)人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/S購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，具有多藥耐藥表型的耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/DOX由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.2 藥品、試劑及主要儀器 阿霉素（DOX）（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司）；水飛薊素（Sily）（80%）干粉（西安小草植物科技有限責(zé)任公司）；維拉帕米（Ver）（上海禾豐制藥有限公司）。DOX用注射用葡萄糖水配成10mg/ml的工作母液，Sily干粉先用DMSO溶解為500mg/ml的工作母液（DMSO 在無(wú)毒劑量?jī)?nèi)），分裝后避光保存于-20℃冰箱，使用時(shí)用培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度應(yīng)用液。MTS（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）；Takara PrimeScript RT Master mix［寶生物工程（大連）有限公司］；SYBR Premix EX TaqTM［寶生物工程（大連）有 限 公 司 ］；Trizol regent（Life Technologies USA）；Real-Time PCR儀器（美國(guó)羅氏公司）；微量核酸測(cè)量?jī)x（one drop spectro photometer）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司）；紅外激光雙色成像系統(tǒng)（Gene Company Limited，odyssey）。

1.3 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將敏感細(xì)胞株MCF-7/S置于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度及5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。耐藥株MCF-7/DOX 培養(yǎng)在含1.0μg/ml的DOX的混合培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件同上。（2）MTS法實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)分為MCF-7/S組、MCF-7/DOX組、MCF-7/DOX+Sily組、MCF-7/DOX+Ver組。取MCF-7/S、MCF-7/DOX的細(xì)胞懸液接種在96孔板內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/DOX和MCF-7/S的細(xì)胞懸液100μl接種在96孔板內(nèi)，作為MCF-7/S組、MCF-7/DOX組，并設(shè)立空白對(duì)照組（只含RM1640培養(yǎng)液）和陰性對(duì)照組（不加藥物）作為對(duì)比。①測(cè)定無(wú)或低細(xì)胞毒作用的Sily的濃度：將敏感組、耐藥組加入不同濃度的Sily，Ver干預(yù)，48h后加入MTS作用3h后用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490nm）檢測(cè)OD值，計(jì)算Sily，Ver無(wú)或低細(xì)胞毒性的濃度范圍。②測(cè)定耐藥組對(duì)DOX的耐藥倍數(shù)：將敏感組、耐藥組同時(shí)加入不同濃度的DOX48h后，加入MTS作用3h后用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490nm）檢測(cè)OD值，計(jì)算DOX對(duì)各組細(xì)胞的IC50和耐藥倍數(shù)（RF）。③測(cè)定Sily對(duì)耐藥組的逆轉(zhuǎn)作用：在實(shí)驗(yàn)②基礎(chǔ)上各組加入 Sily（根據(jù)①的結(jié)果取 10μg/ml）、Ver（5μg/ml），作為MCF-7/DOX+Sily組，MCF-7/DOX+Ver組進(jìn)行干預(yù)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，計(jì)算Sily、Ver作用前后耐藥組IC50的變化，比較Sily與Ver的作用差異。上述實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)6次。（3）RT-PCR法測(cè)定MDR1 mRNA表達(dá)：引物由上海生工合成。MDR1（NM_000927.4）F：5'-TACAGCACGGAAGGCCTAAT-3'，R ：5'-T C T T C A C C T C C A G G C T C A G T-3'，1 2 4 b p；β-a c t i n（N M_0 0 1 1 0 1.3）F：5'-AGTCATTCCAAATATGAGATGCGTT-3'，R：5'-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'，121bp。取四組細(xì)胞適量，加入lml Trizol試劑，加氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇提取總RNA，測(cè)定密度值后，制備RT反應(yīng)液。反應(yīng)條件37℃15min，85℃5s，配成cDNA，加入至RT-PCR反應(yīng)液，反應(yīng)條件為95℃30s-95℃5s-60℃30s，41循環(huán)，每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，內(nèi)參照基因亦設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。（4）Western-Blot法測(cè)定P-gp蛋白的表達(dá)：取4組細(xì)胞適量，加入150μl RIPA細(xì)胞裂解液裂解，用12%SDS-PAGE法分離蛋白質(zhì)，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入P-gp抗體檢測(cè)相應(yīng)蛋白，過(guò)夜、洗膜，二抗遮光溫育90min，洗膜，用紅激光雙色成像系統(tǒng)掃描成像，以β-ACTIN為內(nèi)參抗體，比較各條帶的吸光度值。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sily對(duì)MCF-7/DOX耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用 見表1。

表1 Sily對(duì)MCF-7/DOX耐藥的逆轉(zhuǎn)作用［n=18，（x±s）］

2.2 Sily 對(duì)MCF-7/DOX耐藥細(xì)胞表達(dá)MDR1 mRNA的影響 見表2。

表2 各組MDR1 mRNA表達(dá)水平比較（x±s）

2.3 Sily對(duì)MCF-7/DOX耐藥細(xì)胞表達(dá)P-gp蛋白的影響 見表3、圖1。

表3 各組P-gp蛋白表達(dá)水平比較（x±s）

圖1 Sily 對(duì)MCF-7/DOX耐藥細(xì)胞表達(dá)P-gp蛋白的影響

3 討論

乳腺癌的化療治療在其綜合治療中起著重要的作用，但由于多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，可通過(guò)影響信號(hào)傳導(dǎo)通路及基因的表達(dá)，降低較多抗癌藥物（如阿霉素）的生物活性和效能，成為乳腺癌化療失敗的主要原因［3-4］。臨床傳統(tǒng)克服MDR的方法之一是使用逆轉(zhuǎn)劑，與目前新的納米技術(shù)包埋法［5-6］比較，仍具有價(jià)格便宜，簡(jiǎn)單易行的優(yōu)勢(shì)。然而，由于人體生物利用度差或不良反應(yīng)嚴(yán)重，亦導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用受限。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有治病祛邪、扶助正氣、調(diào)理臟腑的功效，從中藥中尋找高效低毒多靶點(diǎn)的耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究日益增多。本資料顯示，10μg/ml（無(wú)細(xì)胞毒性）的Sily聯(lián)合DOX作用于MCF-7/DOX后能顯著提高DOX對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的殺傷作用，提高耐藥細(xì)胞株對(duì)DOX的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)MCF-7/DOX對(duì)DOX耐藥性的效果。同時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中藥水飛薊素4.75倍的逆轉(zhuǎn)作用，與Ver（逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為5.06倍）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相比文獻(xiàn)中的其他逆轉(zhuǎn)藥如中藥粉防己堿耐藥對(duì)MCF-7/DOX的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.0［7］，大黃素為2.86［8］，Sily具有明顯的高效性特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)。

腫瘤多藥耐藥性是多基因、多階段、多步驟和多因素作用的結(jié)果，其機(jī)制復(fù)雜［9-10］。最常見的耐藥機(jī)制與位于細(xì)胞膜ATP結(jié)合盒的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族）密切相關(guān)，其可以在較短的時(shí)間內(nèi)有效將抗乳腺癌藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，從而降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物含量，使抗腫瘤藥物殺傷力明顯減弱，導(dǎo)致用藥過(guò)程中產(chǎn)生耐藥性［11］。其中最重要的是由MDR1基因編碼P-gp蛋白，其具有經(jīng)典“藥泵”功能，能通過(guò)耗能外排包括抗細(xì)胞增殖藥物等外源性底物，與蒽環(huán)類藥物（如阿霉素）的耐藥密切相關(guān)［12］。而前期研究發(fā)現(xiàn)中藥單體水飛薊素對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX有逆轉(zhuǎn)作用，因此推測(cè)中藥Sily的抗耐藥性可能通過(guò)調(diào)節(jié)MDR1基因表達(dá)P-gp蛋白實(shí)現(xiàn)，但如何調(diào)節(jié)尚不清楚。故通過(guò)RT-PCR、Western-blot的方法，檢測(cè)該基因在Sily干預(yù)下的變化。發(fā)現(xiàn)中藥Sily能夠明顯下調(diào)MCF-7/DOX的MDR1的mRNA及相應(yīng)蛋白P-gp的表達(dá)（P＜0.01），表明Sily的抗耐藥性與調(diào)節(jié)該機(jī)制有關(guān)。此類研究在其他的研究中也得到證實(shí)。如Madhumita Roy等［13］研究發(fā)現(xiàn)中藥姜黃素能夠通過(guò)上調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)宮頸癌對(duì)順鉑的耐藥性；文思群等［14］研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇能夠?qū)562/G01 細(xì)胞阻滯在G1期，下調(diào)P-gp蛋白和BCR/ABL基因表達(dá)等。

此外，據(jù)以往研究表明，Sily不僅對(duì)乳腺癌有防治效果［15］，還對(duì)結(jié)腸癌［16］、前列腺癌、膀胱癌［17］等多種癌癥具有類似的效果，其抗癌機(jī)制呈現(xiàn)多靶點(diǎn)、多機(jī)制聯(lián)合、全方位等特點(diǎn)。如Kai Jiang等［18］研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可以通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡；周大勇等［19］研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓（Sily提取物主要成分）具有明顯的抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的效果，其作用機(jī)制與通過(guò)誘導(dǎo)PUMA蛋白表達(dá)有關(guān)；Rastegar等［20］研究發(fā)現(xiàn)，75μg/ml的Sily夠能有效降低DOX的最佳有效劑量，增強(qiáng)DOX的治療效果，兩者聯(lián)合具有協(xié)同作用。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，作者推測(cè)水飛薊素對(duì)MCF-7/DOX的逆轉(zhuǎn)作用可能與多種通路相關(guān)。

［1］ Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al. Global cancer statistics,2012. CA Cancer J Clin,2015,65(2)：87-108.

［2］ WQ Chen,RS Zheng,PD Baade,et al. Cancer statistics in China.CA Cancer J Clin,2016,66：115-132.

［3］ Gaudiano G, Koch TH, Bello ML, et al. Lack of glutathione conjugation to adriamycin in human breast cancer MCF-7/DOX cells ： Inhibition of glutathione s -transferase p1-1 by glutathione conjugates from anthracyclines. Biochemical Pharmacology,2000,60(12)：1915.

［4］ Park YY, Jung SY, Jennings NB, et al. FOXM1 mediates Dox resistance in breast cancer by enhancing DNA repair.Carcinogenesis, 2012,33(10)：1843-53.

［5］ Patil YB, Swaminathan SK, Sadhukha T, et al. The use of nanoparticle-mediated targeted gene silencing and drug delivery to overcome tumor drug resistance. Biomaterials, 2010,31(2)：358.

［6］ 陳自強(qiáng),張瑋,李玉平,等.納米載體系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)腫瘤及骨肉瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展. 藥學(xué)實(shí)踐雜志,2016,34(2)：103-105.

［7］ 李海燕,陳陽(yáng),何琪楊.苦參堿與粉防己堿逆轉(zhuǎn)人MCF-7細(xì)胞耐藥性的作用與機(jī)制.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(18)：275-278.

［8］ 丘禹洪,周頡.大黃素下調(diào)ERCC1蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥的機(jī)制研究. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,22(4)：226-229.

［9］ Ross DD,Nakanishi T.Impact of breast cancer resistance protein on cancer treatment outcomes. Methods Molbiol,2010,596(6)：251-290.

［10］ Tang J,Wang Y,Wang D,et al.Key structure of Brij for overcoming multidrug resistance in cancer. Biomacromolecul es,2013,14(2)：424-430.

［11］ 齊彩霞.BCRP與P-gp在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義. 山西大同大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(1)：52-53.

［12］ Roundhill EA, Fletcher JI, Haber M, et al. Clinical Relevance of Multidrug-Resistance-Proteins (MRPs) for Anticancer Drug Resistance and Prognosis.// Resistance to Targeted ABC Transporters in Cancer. Springer International Publishing, 2015：27-52.

［13］ Madhumita Roy,Sutapa Mukherjee.Reversal of Resistance towards Cisplatin by Curcumin in Cervical Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,2014,15(3),1403-1410.

［14］ 文思群,馬梁明,鹿育晉,等.雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)伊馬替尼耐藥的K562/G01細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的研究. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2013,21(3)：1148-1152.

［15］ Oh SJ,Jung SP,Kim JH,et al.Silibinin inhibits TPA-induced cell migra-tion and MMP-9 expression in thyroid and breast cancer cells. Oncology Reports,2013,29(4)：1343-1348.

［16］ Akhtar R,Ali M,Mahmood S,et al.Anti-proliferative action of silibinin on human colon adenomatous cancer HT-29 cells.Nutricion Hospitalaria,2014,29(2)：388-392.

［17］ 王紅軍,姜媛媛,路平.水飛薊賓的抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)分子藥理學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(4)：413-421.

［18］ Kai J,Wei W,Xin J,et al.Silibinin,a natural flavonoid,induces Autophagy via ROS-dependent mitochondrial dysfunction and loss of ATP involving BNIP3 in human MCF7 breast cancer cells.Oncology Reports,2015,33(6)：2711-2718.

［19］ 周大勇,還勇為.水飛薊賓抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用及機(jī)制. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2016,24(6)：882-885.

［20］ Rastegar H,Ahmadi Ashtiani H,Anjarani S,et al. The role of milk thistle extract in breast carcinoma cell line(MCF-7)apoptosis with doxorubicin. Acta Med Iran,2013,51(9)：591-598.

國(guó)家自然科學(xué)基金（81473596）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2016R410030）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（2016ZB030）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（吳聰沖 吳青青 喻夏昕 馬芳笑）310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（毛丹漪 劉曉谷）*通信作者