藏紅花酸預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制探討

逯鵬，王佳森，姜善紅，李愛群，姚寶洪，王占青，施真

(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院，山東煙臺264100)

藏紅花酸預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制探討

逯鵬，王佳森，姜善紅，李愛群，姚寶洪，王占青，施真

(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院，山東煙臺264100)

目的探討藏紅花酸對心肌缺血/再灌注(I/R)損傷大鼠心肌組織的影響及其機(jī)制。方法選擇30只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(MI/R組)及藏紅花酸預(yù)處理組(CRO組)各10只。Sham組、MI/R組均予0.5% CMC-Na 10 mL/(kg·d)灌胃預(yù)處理，CRO組予0.5%藏紅花酸50 mg/(kg·d)灌胃預(yù)處理。干預(yù)7 d后，MI/R組、CRO組均開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支45 min，再灌注180 min，建立心肌I/R損傷模型；Sham組開胸后，于冠狀動脈前降支穿線但不予結(jié)扎。造模結(jié)束后，腹主動脈抽血分離血清，采用膠體金法測定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白I(cTnI)水平。取心肌組織，采用HE染色法觀察心肌細(xì)胞病理變化，采用免疫組織化學(xué)SV超敏兩步法檢測心肌細(xì)胞色素C(CytC)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)蛋白表達(dá)。結(jié)果Sham組心肌間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列整齊；MI/R組可見心肌組織明顯壞死區(qū)，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤；CRO組心肌組織壞死及炎細(xì)胞浸潤較MI/R組明顯減輕。MI/R組血清CK-MB、cTnI水平均高于Sham組，CRO組血清CK-MB、cTnI水平均低于MI/R組(P均<0.05)。MI/R組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達(dá)均高于Sham組(P均<0.05)，CRO組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達(dá)均低于MI/R組(P均<0.01)。結(jié)論藏紅花酸預(yù)處理可明顯減輕大鼠心肌I/R損傷，其機(jī)制可能與抑制CytC/Caspase-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

藏紅花酸；心肌缺血；缺血再灌注損傷；細(xì)胞色素C；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9

冠心病是指冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，快速有效地恢復(fù)缺血心肌的再灌注，是治療的最根本措施[1]。但恢復(fù)正常的血流灌注后，缺血區(qū)的損傷反而加重，引發(fā)心肌缺血/再灌注(I/R)損傷[2]。如何減少乃至消除心肌I/R損傷，是目前冠心病血管再通治療中急需解決的難題。因此，尋找可用于治療心肌I/R損傷的有效藥物，對于冠心病血管再通治療具有重要意義。藏紅花酸是藏紅花提取物的主要活性成分之一，屬類胡蘿卜素物質(zhì)，具有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu)，既往研究表明其具有防止動脈粥樣硬化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、清除氧自由基等作用[3，4]。本課題組前期研究表明，藏紅花可以通過抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌I/R損傷[5～7]。研究表明，細(xì)胞色素C(CytC)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)信號通路介導(dǎo)了心肌缺血損傷細(xì)胞的凋亡過程[8]。但目前，藏紅花酸對心肌I/R損傷的影響及其機(jī)制是否與CytC/Caspase-9有關(guān)尚不明確。2013年7月～2014年5月，我們對心肌I/R損傷模型大鼠采用藏紅花酸預(yù)處理，探討藏紅花酸預(yù)處理對心肌I/R損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 成年健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(220±20)g，購自山東大學(xué)實(shí)驗動物中心。藏紅花酸試劑購自濟(jì)南浩化實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，使用前應(yīng)用羧甲基纖維素鈉制成0.5%的懸浮液；羧甲基纖維素鈉購自Sigma公司；血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒、CytC及Caspase-9抗兔免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德公司；兔抗大鼠多克隆抗體購自蘇州Immunoway公司。本實(shí)驗通過濱州醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 動物分組及藥物預(yù)處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(MI/R組)及藏紅酸預(yù)處理組(CRO組)，每組各10只。Sham組、I/R組均予0.5% CMC-Na 10 mL/(kg·d)灌胃預(yù)處理，CRO組予0.5%藏紅花酸50 mg/(kg·d)灌胃預(yù)處理，各組均干預(yù)7 d。

1.3 模型制備 各組干預(yù)7 d后，MI/R組、CRO組均制備心肌I/R損傷模型。大鼠禁食6 h，20%烏拉坦8 mL/kg腹腔注射麻醉，應(yīng)用Medlab信號采集系統(tǒng)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于胸骨左緣0.5 cm處剪開胸部皮膚，分離胸大肌和胸小肌，暴露胸腔，剪開心包膜后將心臟擠出胸腔，自左心耳與肺動脈圓錐交界處下約3.5 cm進(jìn)針穿線，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，同時將半徑為1 mm的聚乙烯管置于結(jié)扎線與冠狀動脈之間，拉緊結(jié)扎線使冠狀動脈閉塞，以心電圖出現(xiàn)ST段顯著抬高視為結(jié)扎成功。45 min后取出聚乙烯管，以心臟表面顏色由蒼白色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色及抬高的ST段下降≥1/2為再灌注成功標(biāo)志，然后心肌再灌注180 min，建立心肌I/R損傷模型。Sham組以同樣方法開胸后，于冠狀動脈前降支穿線但不予結(jié)扎。

1.4 血清CK-MB及cTnI水平檢測 造模結(jié)束后，經(jīng)腹主動脈穿刺抽血3 mL，離心分離出血清。采用膠體金法測定血清CK-MB及cTnI水平，嚴(yán)格按試劑操作說明書的實(shí)驗步驟進(jìn)行檢測。同一樣品設(shè)置3個平行對照，每組樣品獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 心肌組織病理觀察 各組造模后，取心肌組織，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，奧林巴斯BX41金相顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞病理變化。

1.6 心肌組織CytC及Caspase-9蛋白檢測 取血后，取心肌組織，石蠟包埋切片。采用免疫組織化學(xué)SV超敏兩步法檢測心肌CytC及Caspase-9蛋白表達(dá)。一抗用PBS 緩沖液稀釋(1∶200)。具體步驟按SP試劑盒說明書操作。采用Matic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)采集圖片，每張切片隨機(jī)選取5個視野，通過計算OD值對各組CytC和Caspase-9蛋白表達(dá)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CK-MB及cTnI水平比較 MI/R組血清CK-MB、cTnI水平均高于Sham組，CRO組血清CK-MB、cTnI水平均低于MI/R組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清CK-MB及cTnI水平比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與MI/R組比較，#P<0.05。

2.2 各組心肌組織病理變化 Sham組心肌間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列整齊。MI/R組可見明顯壞死區(qū)，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維腫脹、紊亂。CRO組見少量炎細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞胞核大小均勻，心肌纖維輕度腫脹，與MI/R組相比，心肌炎癥浸潤明顯減輕，心肌局灶性壞死明顯較少。

注：A為Sham組；B為MI/R組；C為CRO組。

2.3 各組心肌組織CytC及Caspase-9蛋白表達(dá)比較 CytC及Caspase-9陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽性表達(dá)細(xì)胞被染成棕黃色。MI/R組細(xì)胞質(zhì)中CytC及Caspase-9蛋白表達(dá)呈深棕黃色，較Sham組顏色深；CRO組CytC及Caspase-9蛋白表達(dá)呈棕黃色，較MI/R組顏色淺。MI/R組心肌CytC、Caspas-9蛋白表達(dá)均高于Sham組(P均<0.05)，CRO組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達(dá)均低于MI/R組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組心肌組織中CytC及Caspase-9蛋白表達(dá)比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與MI/R組比較，#P<0.01。

3 討論

心肌I/R損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴(kuò)大和惡化，是彼此獨(dú)立而又互相聯(lián)系的病理生理過程[2]。再灌注過程中，隨著缺血心肌血流的重建，左心室功能將得到改善，此時合理應(yīng)用抗心肌I/R損傷藥物將增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗再灌注損傷的能力，從而大大降低心肌I/R損傷帶來的危害。因此，心肌I/R的防治要從缺血期開始，盡快解除機(jī)體缺血狀況對減輕因缺血造成的損傷有著非常重要的臨床意義。

藏紅花酸是鳶尾科番紅花屬藏紅花柱頭中的主要化學(xué)成分，研究證明藏紅花酸具有抗動脈粥樣硬化以及減輕腦I/R損傷的作用。Ishizuka等[8]研究表明，藏紅花酸通過減少氧化應(yīng)激和抑制凋亡進(jìn)而抑制小鼠視網(wǎng)膜的缺血性損傷；也有研究證實(shí)藏紅花酸可以通過抑制凋亡來減輕實(shí)驗性失血性休克導(dǎo)致的干細(xì)胞凋亡[9]、通過PI3K/Akt/eNOS通路抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[10]等。但尚沒有藏紅花酸對于心肌I/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡方面的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MI/R組心肌組織可見明顯壞死區(qū)，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維腫脹、紊亂，而CRO組心肌壞死及炎癥浸潤較MI/R組明顯減輕，提示藏紅花酸可以保護(hù)心肌I/R損傷導(dǎo)致的心肌損害。

心肌I/R損傷過程中，由于心肌細(xì)胞膜通透性的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CK-MB漏出增加，因此臨床上常用檢測血清CK-MB含量評估心肌缺血損傷。cTnI是心肌損傷特異性標(biāo)志蛋白[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI/R組血清CK-MB、cTnI水平均高于Sham組，CRO組血清CK-MB、cTnI水平均低于MI/R組，提示藏紅花酸可以改善心肌細(xì)胞膜通透性、減輕心肌細(xì)胞的損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R損傷的機(jī)制有氧自由基過多[12]、鈣超載[13]、能量代謝障礙以及細(xì)胞凋亡[14,15]等。實(shí)驗研究表明，CytC從線粒體內(nèi)釋放出來是細(xì)胞凋亡的重要步驟[16]。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的CytC在dATP存在的條件下，能與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，形成多聚體之后與Caspase-9結(jié)合，一方面形成凋亡小體，另一方面可同時激活Caspase-9，進(jìn)而激活如Caspase-3等的其他Caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還通過釋放凋亡誘導(dǎo)因子參與激活Caspase。因此，CytC從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，并進(jìn)而激活Caspase-9，是細(xì)胞凋亡研究的關(guān)鍵問題。近年來，藏紅花酸抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制已成為心肌I/R研究的熱門。本課題組前期研究表明，藏紅花酸可抑制缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的凋亡[5～7]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI/R組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達(dá)均高于Sham組，CRO組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達(dá)均低于MI/R組，提示藏紅花酸可降低心肌I/R損傷后心肌CytC、Caspase-9蛋白表達(dá)，可能與藏紅花酸抑制I/R損傷、發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用有關(guān)。

綜上所述，藏紅花酸預(yù)處理可明顯減輕心肌I/R損傷大鼠的心肌損傷，其機(jī)制可能是通過抑制CytC/Caspase-9蛋白的活化，從而抑制I/R損傷、發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。本研究為藏紅花酸在心肌I/R損傷治療中的應(yīng)用及臨床治療方案的優(yōu)化提供了依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.011

R542.2

A

1002-266X(2017)46-0041-03

山東省煙臺市科技發(fā)展計劃(2012108)。

王佳森(E-mail:) 施真(E-mail: zhen_shizhen@163.com)

2017-05-10)