白藜蘆醇后處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的影響及機制

劉皓，曲一丹，劉興基，李衛紅，桑慧，司艷紅，商戰平

(泰山醫學院，山東泰安271000)

·基礎研究·

白藜蘆醇后處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的影響及機制

劉皓，曲一丹，劉興基，李衛紅，桑慧，司艷紅，商戰平

(泰山醫學院，山東泰安271000)

目的探討白藜蘆醇后處理對腎臟缺血再灌注(I/R)損傷的影響及其機制。方法將60只大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組，每組各15只。模型對照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組制備急性腎臟I/R模型，假手術組僅行假手術，對雙側腎臟不進行處理。白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組造模成功后，待腎臟血流恢復后用16號灌胃針進行灌胃給藥。假手術組及模型對照組術后立即灌胃0.9%NaCl溶液2 mL。給藥處理24 h后，經腹主動脈取血，檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。取左側腎臟，配成腎組織勻漿，檢測丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用HE染色法觀察病理學變化，Paller法進行腎小管壞死程度評分。結果白藜蘆醇低、高劑量組血清BUN、Cr水平均低于模型對照組(P均<0.05)，白藜蘆醇高劑量組血清BUN、Cr水平均低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組腎組織MDA含量低于模型對照組，SOD活性高于模型對照組(P均<0.05)；白藜蘆醇高劑量組腎組織MDA含量低于白藜蘆醇低劑量組，SOD活性高于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組腎臟組織病理學改變較模型對照組明顯緩解，白藜蘆醇高劑量組緩解更明顯。白藜蘆醇低、高劑量組腎小管壞死程度評分低于模型對照組，白藜蘆醇高劑量組低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。結論白藜蘆醇后處理可明顯改善腎臟I/R損傷大鼠的腎功能指標、減輕腎臟組織損傷，其機制可能與抑制腎臟組織氧化應激反應有關。

白藜蘆醇；腎臟；缺血再灌注損傷；藥物后處理；氧化應激

腎臟缺血再灌注(I/R)損傷在臨床中多見，其大多發生于休克、血管手術或腎臟移植術過程中[1]。腎臟I/R損傷是導致急性腎衰竭(ARF)的常見原因，是導致患者死亡的重要原因[2]。近些年，用藥物后處理的方法來改善腎臟I/R損傷的方式引起了更多的關注。白藜蘆醇是一種天然多酚類化學物質，具有抑制炎癥反應、抗腫瘤作用和抗氧化作用等多種功能，并可顯著減輕多種器官的I/R損傷[3]。但既往大多采用白藜蘆醇預處理的方式研究其對腎臟I/R的保護作用，對其在腎臟I/R損傷后處理中的作用尚不明確。2016年5～12月，我們觀察了白藜蘆醇后處理對腎臟I/R模型大鼠的影響，探討白藜蘆醇后處理對腎臟I/R損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康雄性Wistar大鼠60只，CL級，8周齡，體質量200～250 g，由山東大學實驗動物中心提供。白藜蘆醇購自美國Sigma公司；考馬斯亮藍、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Cr)含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；戊巴比妥鈉購自南京都萊生物有限公司。

1.2 動物分組與模型制備 采用簡單隨機化法將60只大鼠按照1∶1∶1∶1分配到假手術組、模型對照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組，每組各15只。模型對照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組制備急性腎臟I/R模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，腹正中線行小切口，將兩側腎蒂游離并剝離周圍組織，結扎右腎腎蒂，使用動脈夾將左腎腎蒂夾閉48 min后松開移去，恢復血流再灌注，然后逐層縫合。移除動脈夾后，當觀察到腎表面顏色從暗紫色變化為血色時，表明血流恢復，急性腎臟I/R模型制備成功。假手術組只進行腹部小切口操作后，用0.9%NaCl溶液濕潤的消毒紗布進行覆蓋，對雙側腎臟不進行任何處理。

1.3 干預方法 白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組造模后立即進行后處理，進行灌胃給藥，待腎臟血流恢復后用16號灌胃針進行灌胃給藥。假手術組及模型對照組術后立即灌胃0.9%NaCl溶液2 mL。

1.4 血清BUN、Cr水平測定 給藥后處理24 h后，麻醉大鼠，開腹經腹主動脈取血，離心留取血清，依照試劑盒的操作說明，檢測血清BUN、Cr水平。

1.5 腎組織MDA含量及SOD活性測定 取血后處死各組大鼠，取左側腎臟，取部分腎皮質，配成10%的腎臟組織勻漿，依照試劑盒標準操作方式檢測MDA含量及SOD活性。

1.6 腎組織病理組織觀察及腎小管壞死程度評分取腎臟組織，制備石蠟切片，采用HE染色法觀察組織學形態與病理學變化。按Paller法[4]進行腎小管壞死程度評分，評分標準：腎小管擴張、細胞扁平為1分；腎小管腔內有脫落、 壞死的細胞，無管型或細胞碎片為2分；上皮細胞顆粒變性為1分；空泡變性為1分；細胞核固縮為1分。

2 結果

2.1 各組血清BUN、Cr水平比較 模型對照組血清 BUN、Cr水平均高于假手術組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組血清BUN、Cr水平均低于模型對照組(P均<0.05)。白藜蘆醇高劑量組血清BUN、Cr水平均低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清BUN、Cr水平比較

注：與模型對照組比較，*P<0.05； 與白藜蘆醇低劑量組比較，#P<0.05。

2.2 各組腎組織MDA含量及SOD活性比較 模型對照組腎組織MDA含量高于假手術組，SOD活性低于假手術組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組腎組織MDA含量低于模型對照組，SOD活性高于模型對照組(P均<0.05)。白藜蘆醇高劑量組腎組織MDA含量低于白藜蘆醇低劑量組，SOD活性高于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組腎臟組織病理學表現及腎小管壞死程度評分比較 假手術組腎臟組織形態結構正常，小管管腔完好，未見間質水腫與組織炎細胞浸潤現象，上皮細胞無水腫、壞死。模型對照組腎臟組織形態結構明顯異常，小管管腔顯著擴張，上皮細胞出現明顯的腫脹、壞死，并且出現管型、炎細胞浸潤、間質水腫現象。白藜蘆醇低、高劑量組腎臟組織形態結構均有輕微變化，小管上皮細胞以腫脹為主，壞死罕見，炎細胞浸潤、間質水腫的現象與模型組相比顯著緩解，管腔中見到脫落細胞以及管型的現象明顯少于模型對照組，病理學改變較模型對照組明顯緩解。白藜蘆醇高劑量組病理改變較白藜蘆醇低劑量組明顯改善。假手術組、模型對照組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組腎小管壞死程度評分分別為(1.15±0.32)、(35.87±1.50)、(4.50±1.41)、(8.76±1.60)分，模型對照組高于假手術組，白藜蘆醇低、高劑量組均低于模型對照組，白藜蘆醇高劑量組低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。

表2 各組腎組織MDA含量及SOD活性比較

注：與模型對照組比較，*P<0.05； 與白藜蘆醇低劑量組比較，#P<0.05。

3 討論

目前，對腎臟I/R損傷進行藥物預處理的預防與治療的研究已取得較好的進展[5]，顯示出明顯的治療效果。但在實際的臨床診療中，更多見的是由于腎臟發生缺血后造成損傷來就醫的，目前并無法在缺血發生之前預知其發生，進而采用藥物預處理進行干預，這一局限性限制了藥物預處理方法在臨床I/R損傷治療中的應用。藥物后處理指的是在組織器官缺少血液灌流較長時間的情況下，在血流恢復之前或者開始恢復數分鐘以內用藥[6]。對I/R損傷進行藥物后處理的方式具有事后性的特點，是近年來提出的新的器官保護策略，并且具有廣闊的研究前景。因此，探討對腎臟I/R損傷進行藥物后處理治療更加重要。

白藜蘆醇是一種存在于漿果、花生皮、葡萄等中的天然多酚類化學物質，具有許多有益的健康效應，如抗炎、抗衰老、抗腫瘤等。近年研究發現，白藜蘆醇具有較強的抵抗氧化損傷的功能，可作為一種活性氧(ROS)清除劑[6]。白藜蘆醇還能夠通過轉錄調節來調節抗氧化酶活性，增加抗氧化作用，是一種有效的抗氧化劑[16]。研究發現，白藜蘆醇可顯著減輕多種器官及組織如骨骼肌、神經、心臟、肝臟、胃、腸道及腎臟的I/R損傷[7～13]。白藜蘆醇擁有對臟器I/R損傷較好的保護作用與良好的應用價值，是近年來的研究熱點。本研究發現，模型對照組血清 BUN、Cr水平高于假手術組，提示腎臟I/R損傷導致了大鼠腎功能損害,血清BUN、Cr水平顯著增加，并出現腎臟的病理性損害；白藜蘆醇低、高劑量組血清BUN、Cr水平均低于模型對照組，白藜蘆醇高劑量組血清BUN、Cr水平均低于白藜蘆醇低劑量組，提示使用白藜蘆醇后處理給藥后減輕了上述改變，能夠明顯減輕腎臟I/R損傷，起到保護腎功能與降低腎臟病理性損害的作用，并且高劑量應用時的保護作用更明顯。

研究顯示，腎臟I/R損傷出現時高度破壞腎組織，并啟動了一系列促使細胞凋亡和壞死的程序。這些有害的效應被證實是由于腎再灌注時由ROS產生的[14]。特別是在再灌注期間，I/R后發生的組織損傷與部分組織中增加的氧化應激反應密切相關[15]。在腎臟I/R損傷的進程發生時，ROS在機體內開始形成并積聚，從而使得氧自由基持續產生。同時，腎臟細胞線粒體缺氧使抗氧化物酶的活性減弱，清除氧自由基的作用降低，機體自由基防御系統受到了破壞，導致了氧化應激損傷細胞，進而促進細胞死亡。SOD是人體中主要存在的自由基清除劑，對保護腎臟組織抵抗自由基所造成的損害有重要意義，其活性水平可以用于評價機體自由基的清除作用。多不飽和脂肪酸存在于生物膜當中，體內ROS能夠與它產生化學變化，導致脂質過氧化(LPO)現象出現，以致于生成能夠對組織細胞產生損傷的毒害性產物，如MDA。MDA能夠有效衡量體內自由基對細胞損傷程度，有助于判斷LPO的發生對組織細胞所造成的損傷水平。本研究發現，模型對照組腎組織MDA含量高于假手術組，SOD活性低于假手術組，提示大鼠急性腎臟I/R的發生導致了機體氧化應激的損傷；白藜蘆醇低、高劑量組腎組織MDA含量低于模型對照組，SOD活性高于模型對照組，提示白藜蘆醇后處理能夠顯著減少腎臟I/R損傷中腎組織MDA含量、提升SOD活力，表明應用白藜蘆醇對急性腎臟I/R損傷進行后處理能夠有效降低體內氧自由基含量，并加強腎組織對自由基清理的功能，以此來抵抗LPO損傷，能夠使機體抵御氧化毒性產物對組織細胞的破壞，減少組織細胞的損傷與壞死，從而進一步減輕I/R損傷；白藜蘆醇高劑量組腎組織MDA含量低于白藜蘆醇低劑量組，SOD活性高于白藜蘆醇低劑量組，提示高劑量應用時的保護作用更明顯。

臨床上腎臟I/R損傷是出現急性腎功能衰竭的主要原因，可導致腎血管阻力增加、腎小球濾過率下降、腎小管壞死等。本研究發現，模型對照組腎臟組織形態結構明顯異常，小管管腔顯著擴張，上皮細胞出現明顯的腫脹、壞死，并且出現管型、炎細胞浸潤、間質水腫現象，提示腎臟I/R損傷造成了腎組織的嚴重損傷；白藜蘆醇高劑量組、低劑量組腎臟組織病理形態結構與模型組相比顯著緩解，提示該藥物可減弱腎臟I/R損傷，減輕腎組織受損的程度；白藜蘆醇高劑量組病理改變較白藜蘆醇低劑量組明顯改善，提示高劑量應用時可更好地減輕腎組織病理改變。本研究發現，模型對照組腎小管壞死程度評分高于假手術組，提示腎臟I/R損傷造成了腎組織中大量腎小管損傷，腎小管受到嚴重破壞；白藜蘆醇低、高劑量組低于模型對照組，白藜蘆醇高劑量組低于白藜蘆醇低劑量組，提示白藜蘆醇可減輕腎組織腎小管的損傷程度，對腎臟起到一定的保護作用，并且高劑量應用時可更好地減輕腎組織腎小管的損傷程度。

綜上所述，白藜蘆醇后處理可減輕腎臟I/R損傷，改善腎臟功能、減輕腎組織腎小管的損傷程度，其作用可能與抑制氧化應激反應有關，從而減少了氧化應激所造成組織損傷，表明白藜蘆醇后處理對腎臟I/R模型大鼠的腎臟具有保護作用。然而，由于腎臟I/R損傷發生機制、該藥物的作用機理以及藥物后處理機制的復雜性，白藜蘆醇后處理對抗腎臟I/R損傷的機制有待更進一步研究。

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國家級大學生創新創業計劃項目(201610439014)。

商戰平(E-mail: zhpshang@tsmc.edu.cn)

2017-04-16)