胡桃醌對前列腺癌細胞雄激素受體及PI3K/AKT通路蛋白表達的影響

方芳，馬靜，崔家博，王立國

(吉林醫藥學院檢驗學院，吉林吉林132013)

胡桃醌對前列腺癌細胞雄激素受體及PI3K/AKT通路蛋白表達的影響

方芳，馬靜，崔家博，王立國

(吉林醫藥學院檢驗學院，吉林吉林132013)

目的探討胡桃醌對人前列腺癌LNCaP 細胞雄激素受體(AR)及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路蛋白表達的影響。方法培養人前列腺癌LNCaP細胞，分為空白對照組、胡桃醌低劑量組、胡桃醌中劑量組及胡桃醌高劑量組。分別加入終濃度為12.5、25和50 μmol/L胡桃醌作用24 h，空白對照組不加入胡桃醌。采用Western blotting法檢測磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AR、β-catenin蛋白表達。為觀察LY294002與胡桃醌對PI3K/AKT信號通路是否具有交互作用，將LNCaP細胞分為空白對照組、胡桃醌組、LY294002組、胡桃醌+LY294002組，胡桃醌組加入胡桃醌50 μmol/L，LY294002組加入LY294002 20 μmol/L，胡桃醌+LY294002組加入LY294002 20 μmol/L及胡桃醌50 μmol/L，空白對照組不加入LY294002及胡桃醌，各組干預24 h后，采用Western blotting法檢測p-AKT、β-catenin、AR及AR下游分子前列腺特異性抗原(PSA)的表達變化。結果與空白對照組比較，胡桃醌低、中、高劑量組p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達均降低(P均<0.05)。與胡桃醌組、LY294002組比較，胡桃醌+LY294002組p-AKT、β-catenin、AR及PSA蛋白表達均降低(P均<0.05)。結論胡桃醌能夠抑制前列腺癌細胞AR的表達，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路導致AR共刺激分子β-catenin表達下降有關。

胡桃醌；前列腺癌；雄激素受體；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一。針對雄激素-雄激素受體(AR)的雄激素剝奪療法(ADT)是治療中晚期前列腺癌的主要手段。前列腺是雄激素依賴性器官，AR在去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)發生過程中起著核心作用，仍然是臨床治療CRPC的有效靶點[1,2]。因此，發掘新的藥物和治療方法，改善CRPC的療效和預后，就成為目前前列腺癌領域的研究熱點[3]。胡桃醌是從胡桃楸的外殼中提取的一種活性成分，具有促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長的作用[4,5]。我們前期研究發現，胡桃醌具有抑制前列腺癌細胞生長、促進前列腺癌細胞凋亡作用[6]。然而，胡桃醌對前列腺癌細胞中AR的表達是否有影響及其機制尚不明確。2015年1月～2017年1月，本研究通過觀察胡桃醌對人前列腺癌LNCaP細胞AR表達及其作用機制，探討胡桃醌抑制前列腺癌細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 前列腺癌LNCaP細胞(上海中國科學院細胞庫)；胡桃醌(美國Sigma公司)；兔抗磷酸化蛋白激酶 B (p-AKT)、β-catenin、前列腺特異性抗原(PSA)、β-actin抗體和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT通路抑制劑LY294002(美國Cell Signaling Technology公司)；AR(美國Santa Cruz公司)。

1.2 細胞培養、分組及干預方法 人前列腺癌LNCaP細胞于37 ℃、5%CO2培養箱中，用RPMI 1640+10% FCS培養，隔日換液。分為空白對照組、胡桃醌低劑量組、胡桃醌中劑量組及胡桃醌高劑量組。胡桃醌低、中、高劑量組分別加入終濃度為12.5、25和50 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h，空白對照組不加入LY294002及胡桃醌。

1.3 p-AKT、p-AR及β-catenin蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測。提取細胞總蛋白，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠上蛋白移至醋酸纖維素膜，于50 g/L脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗p-AKT、β-catenin、AR(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。次日TBST洗膜，分別加HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜，加底物發光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.4 胡桃醌與LY294002交互作用觀察 分為空白對照組、胡桃醌組、LY294002組、胡桃醌+LY294002組，胡桃醌組加入胡桃醌50 μmol/L，LY294002組加入LY294002 20 μmol/L，胡桃醌+LY294002組加入LY294002 20 μmol/L及胡桃醌50 μmol/L，空白對照組不加入LY294002及胡桃醌。各組干預24 h后，采用Western blotting法檢測p-AKT、β-catenin、AR及AR下游分子PSA的表達變化，方法同1.3。

2 結果

2.1 各組p-AKT、AR、β-catenin蛋白表達比較 與空白對照組比較，胡桃醌低、中、高劑量組p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達均降低(P均<0.05)，詳見表1、圖1。

表1 各組p-AKT、AR及β-catenin蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05，﹟P<0.01。

圖1 各組p-AKT、AR及β-catenin蛋白表達情況(Western blotting法)

2.2 胡桃醌與LY294002交互作用結果 與胡桃醌組、LY294002組比較，胡桃醌+LY294002組p-AKT、β-catenin、AR及PSA蛋白表達均降低(P均<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 胡桃醌與LY294002交互作用對p-AKT、β-catenin、AR、PSA蛋白表達的影響

注：與胡桃醌+LY294002組比較，*P<0.05。

圖2 胡桃醌與LY294002交互作用對p-AKT、β-catenin、AR、PSA蛋白表達的影響(Western blotting法)

3 討論

近年來由于飲食結構改變和人口老齡化，我國前列腺癌發病率逐年增高[7]。患者在接受ADT治療后2～3年內，往往由雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)轉化為CRPC。CRPC是前列腺癌病程中的致死性階段，盡管采用新型ADT藥物、化療、核素與生物治療等方法可使CRPC的預后有所改善，但是患者的平均存活期仍不足2年[8]。因此，發掘新的藥物和治療方法，改善CRPC的療效和預后，就成為目前前列腺癌領域的研究熱點。

CRPC是前列腺癌病程中的致死性階段，AR在CRPC發生中起著核心作用。AR通過基因擴增、突變、剪接體、共激活因子和信號通路活化等途徑導致其異常表達或(和)活化，使ADPC細胞增殖并最終導致CRPC[9,10]。AR通路是CRPC諸多形成機制中的共同點，在ADPC 進展為CRPC的過程中起著核心作用。AR引發CRPC的機制主要有AR點突變、AR過表達、AR共激活因子促進AR異常活化等[11]。因此，AR亦是CRPC 的治療靶點。PSA是AR調節的下游靶分子，AR可以促進PSA基因的轉錄及其表達。PSA是前列腺癌的特異性標志物，PSA增高是診斷前列腺癌發生發展的標志物。

我國的藥用植物資源豐富，已發現多種植物成分具有抗癌作用。人們很早就發現核桃楸樹皮及果皮具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲的作用，在中國許多治療癌癥的驗方中都含有核桃楸成分。研究發現，核桃楸中具有抗腫瘤、抗炎及殺蟲作用的有效成分是胡桃醌。本研究表明，胡桃醌作用前列腺癌LNCaP細胞后p-AKT、AR及AR的共刺激分子β-catenin 蛋白表達逐漸下降。PI3K/AKT信號通路在腫瘤細胞中起著重要的調節作用，具有促進腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、血管生成等作用。研究表明，PI3K/AKT通路可以調節β-catenin的轉錄活性。β-catenin是AR的共激活因子，β-catenin能與AR結合，有效協助AR誘導AR調控基因的表達。本研究表明，胡桃醌低、中、高劑量組p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達均降低，提示胡桃醌能夠降低p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達。

進一步證實胡桃醌、PI3K/AKT信號通路與AR之間的關系，本研究采用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002與胡桃醌共同作用細胞24 h，觀察LY294002與胡桃醌對于PI3K/AKT信號通路是否具有交互作用。本研究結果表明，LY294002與胡桃醌間具有交互效應，胡桃醌+LY294002組p-AKT、β-catenin、AR及PSA蛋白表達表達均降低，提示LY294002與胡桃醌間的交互效應可使p-AKT、β-catenin、AR和PSA蛋白表達表達明顯降低，抑制PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，胡桃醌能夠抑制前列腺癌細胞AR及其下游分子PSA的表達，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路導致AR共刺激分子β-catenin表達下降有關。

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JugloneinhibitsARexpressionthroughPI3K/AKTpathwayinhumanprostatecancercells

FANGFang,MAJing,CUIJiabo,WANGLiguo

(CollegeofLaboratory,JilinMedicalUniversity,Jilin132013,Chain)

ObjectiveTo investigate the effects of juglone on the androgen receptor (AR) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT pathway expression in the prostate cancer LNCaP cells.MethodsThe human prostate cancer LNCaP cells were divided into the blank control group (without juglone), the low-dose juglone group (12.5 μmol/L), medium-dose juglone group (25 μmol/L) and high-dose juglone group (50 μmol/L). After the cells in each group were treated for 24 h, Western blotting was used to detect the expression of p-AKT, AR and β-catenin. In order to observe whether LY294002 and juglon had interaction on PI3K/AKT signal pathway, LNCaP cells were divided into the blank control group (without juglone and LY294002), juglone group (50 μmol/L juglone), LY294002 group (20 μmol/L LY294002), juglone and LY294002 group (50 μmol/L Juglone and 20 μmol/L LY294002). Cells in each group were treated for 24 h and Western blotting was used to detect the expression of p-AKT, AR, β-catenin, and prostate-specific antigen (PSA).ResultsCompared with the blank control group, the p-AKT, β-catenin and AR expression levels of LNCaP cells decreased in the low-dose, medium-dose and high-dose juglone groups (allP<0.05). Compared with the juglone group and LY294002 group, the expression levels of p-AKT, β-catenin, AR, and PSA decreased in the juglone and LY294002 groups (allP<0.05).ConclusionJuglone can inhibit the expression of AR in the prostate cancer cells, and its mechanism may be that the inhibition of PI3K/AKT signaling pathways leads to the decrease of β-catenin expression.

juglone; prostate carcinoma; androgen receptor; phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.006

R737.25

A

1002-266X(2017)46-0024-03

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究[吉教科合字(2014)第360號]。

方芳(1973-)，女，博士，副教授，研究方向為腫瘤的藥物治療。E-mail: jillmcfang@163.com

王立國(1971-)，男，博士，主任醫師，研究方向為腫瘤的藥物治療。E-mail： urolancet@sina.com

2017-08-13)