盆腔臟器脫垂患者主韌帶和宮骶韌帶組織中神經肽Y、神經肽Y受體的表達變化及意義

陳霞，詹安娜，蔣麗萍

(吉安市婦幼保健院，江西吉安343000)

盆腔臟器脫垂患者主韌帶和宮骶韌帶組織中神經肽Y、神經肽Y受體的表達變化及意義

陳霞，詹安娜，蔣麗萍

(吉安市婦幼保健院，江西吉安343000)

盆腔臟器脫垂；神經肽Y；神經肽Y受體；主韌帶；宮骶韌帶

女性盆腔臟器脫垂是由各種原因導致的盆底支持組織薄弱，造成盆腔器官下降移位引發器官的位置及功能異常；其以外陰部塊物脫出為主要癥狀，伴或不伴有排尿、排便異常，外陰部出血、炎癥等，不同程度地影響患者的生活質量[1]。盆腔臟器脫垂可能是解剖、生理、遺傳、生活方式和分娩等眾多因素相互影響，并最終導致盆底功能障礙。有2/3的經產婦在解剖學上有盆腔臟器脫垂跡象，但大部分婦女無癥狀[2～4]。研究認為，神經損傷、神經遞質減少或其他原因造成盆底血管改變，血流灌注不足，導致盆腔臟器相應的結構代謝改變和成分變化，從而發生盆腔臟器脫垂[5]。神經肽Y是重要的血管活性肽，是由36個氨基酸組成的多肽，通過激活不同的受體發揮生物學作用。研究顯示，盆腔臟器脫垂患者肛提肌中神經肽Y、血管活性腸肽和P物質等肽能神經顯著減少甚至缺失。可見神經肽Y在盆腔臟器脫垂的發病中可能起重要作用[6]。2015年10月～2017年4月，本研究對不同程度盆腔臟器脫垂患者不同部位神經肽Y及其受體表達進行觀察，并探討二者表達變化的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選盆腔臟器脫垂患者50例，均為子宮脫垂，均經手術治療。患者年齡33～75(62.07±10.34)歲。按盆腔臟器脫垂定量評估體系(POP-Q)對盆腔臟器脫垂分度：Ⅰ度6例，Ⅱ度20例，Ⅲ度14例，Ⅳ度10例。將Ⅰ、Ⅱ度作為脫垂1組，Ⅲ、Ⅳ度作為脫垂2組。脫垂1組年齡34～75(60.07±8.85)歲；孕次(2.0±0.7)次，產次(1.9±0.4)次；BMI(23.7±2.4)kg/m2；脫垂2組年齡33～73(63.01±9.95)歲；孕次(2.5±0.9)次，產次(2.3±0.6)次；BMI(24.9±1.8)kg/m2。同期選擇宮頸癌患者30例作為對照組，均無盆腔臟器脫垂，均經手術治療。年齡37～72(62.19±10.37)歲；孕次(2.2±0.6)次，產次(2.0±0.7)次；BMI(23.7±2.1)kg/m2。患者均已婚；有經陰道分娩史；近3個月內無激素類藥物使用史；無其他結締組織疾病、雌激素相關性疾病、周圍神經疾病及脊柱外傷史。三組年齡、孕次、產次及BMI有可比性。

1.2 組織標本的提取及處理 三組均于術中切除主韌帶和宮骶韌帶組織標本，于靠近子宮動脈下方1 cm處取主韌帶組織，于韌帶與宮頸連接處以外0.5 cm處取宮骶韌帶。一部分經甲醛固定，石蠟包埋，另外一部分放入Eppendorf管中保存。

1.3 主韌帶和宮骶韌帶組織神經肽Y蛋白表達的檢測 采用免疫組化法。將組織切片室溫下經二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水脫蠟，3%過氧化氫浸泡10 min,PBS沖洗×3次×3 min，經胃蛋白酶消化60 min,蒸餾水沖洗3 min,加血清、一抗，于4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗×3次×5 min，加二抗，37 ℃放置30 min，PBS沖洗×3次×5 min。DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水反藍30 min。常規脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化結果判斷：在200倍光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機抽取5個視野進行計數。按細胞有無顯色或顯色深淺計分：無顯色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；按顯色細胞比例計分：顯色細胞<1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～100%計3分。根據陽性細胞染色深淺和陽性細胞占組織細胞總數的百分數進行計分，以兩者計分的乘積作為最終判斷標準：0為陰性；1～4為弱陽性；6為陽性；9為強陽性；≥6為高表達，<6為低表達或不表達。

1.4 主韌帶和宮骶韌帶組織Y1受體、Y2受體mRNA表達的檢測 采用RT-PCR法。取出液氮標本，每100 g組織中加入TRIzol 1 mL,提取總RNA。取RNA 1.25 μL經反轉錄合成cDNA。PCR反應條件：94 ℃預變性、3 min；94 ℃、40 s,退火40 s;72 ℃、40 s，35個循環。Y1受體退火溫度為52.5 ℃，Y2受體退火溫度為50.7 ℃。擴增后72 ℃延伸7 min。實驗用引物序列：Y1受體上游引物：5′-GGTCTTIGGTGAGGCGAT-3′，下游引物：5′-GCTGTGAGGTGGCAGAGC-3′；Y2受體上游引物：5′-CTGCTCCATCATCTTGCT-3′，下游引物：5′-CTGGCTGTCAATGTCAAC-3′；內參上游引物：5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游引物：5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′。通過凝膠成像分析軟件檢測神經肽Y受體mRNA的表達，其相對表達量為神經肽Y受體PCR灰度值/內參PCR灰度值。

2 結果

2.2 各組主韌帶與宮骶韌帶組織中Y1受體、Y2受體 mRNA表達比較 見表1。

表1 各組主韌帶與宮骶韌帶組織中神經肽Y受體mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與脫垂1組比較，#P<0.05。

2.3 主韌帶與宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達與Y2受體mRNA表達的相關性 主韌帶組織中Y1受體 mRNA表達與Y2受體 mRNA表達呈正相關(r=0.479,P<0.05)，宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達與Y2受體 mRNA表達無相關性(r=0.173,P>0.05)。

3 討論

多層肌肉和筋膜組成女性盆底，盆底中有尿道、陰道和直腸穿出。子宮、膀胱、直腸等盆腔器官正常位置的保持有賴于盆底組織的支持。盆腔臟器脫垂的主要原因為盆底肌肉和筋膜組織的薄弱[7]。盆腔臟器脫垂的影響因素包括易感因素、誘發因素、促發因素、失代償因素，以上均可導致盆底支持薄弱。絕經后的盆底組織退化性改變、陰道分娩損傷、有腹壓增高的疾病是盆腔臟器脫垂最常見的發病原因[8]。分娩過程中軟產道及其周圍的盆底組織擴張，導致肌纖維拉長、撕裂，損傷盆底神經，尤其是產后過早參加體力勞動，盆底組織張力恢復緩慢。目前隨著產科技術的提高，因為產傷造成的盆底功能障礙已明顯減少。隨著社會人口的老齡化，因為絕經后雌激素水平下降及盆底肌肉韌帶組織支持力下降，導致盆腔臟器脫垂成為中老年婦女的常見病，一定程度地影響婦女生活質量[9]。根據發生部位，盆腔器官脫垂分為陰道前壁膨出、陰道后壁膨出、陰道頂脫垂、子宮脫垂、腸疝。部分患者同時存在多部位脫垂。輕度盆腔器官脫垂患者一般無不適，但是重度患者可有不同程度的腰骶部酸痛或下墜感、陰道塊狀物脫出、站立過久或勞累后癥狀明顯，可伴有排便、排尿困難。本研究對神經肽Y及其受體在盆腔臟器脫垂患者主韌帶和宮骶韌帶組織的表達變化進行觀察，以探討神經肽Y及其受體在盆腔臟器脫垂發生發展中的作用，為臨床診治提供參考。

神經肽Y是一種維持內環境穩態的激素，與應激關系密切，廣泛存在于外周和中樞，在應激引起的心血管疾病中起重要調節作用；在中樞有抗焦慮、癲癇，抑制生殖、肌肉興奮、交感興奮等作用，可使機體血壓、心率、代謝下降；可促進食欲[10，11]；其外周主要作用是促進血管平滑肌收縮和血管再生，對小動脈有收縮作用，能參與生殖道局部血流的神經調節。神經肽Y受體屬于跨膜7次的G蛋白偶聯受體，目前發現在人體中有5種受體，其中Y1、Y2、Y4、Y5受體均已經被克隆。Y1受體主要位于突觸后膜，分布于血管平滑肌，與血管收縮和血管平滑肌再生相關，Y2和Y5受體位于突觸前膜，抑制去甲腎上腺素的釋放，與血管生成及再生相關。Y4受體主要與進食行為相關。神經肽Y能上調自身受體表達。突觸后的受體Y1直接或間接地介導了血管收縮，其作用機制可能為增強去甲腎上腺素的作用及刺激平滑肌細胞增殖。Y1、Y5受體在粥樣斑塊形成過程中發揮重要作用。Y2受體通過本身或與Y5受體協同作用促進粥樣硬化斑塊的形成；二者可刺激內皮細胞增生、遷移和毛細血管形成。除具有致粥樣斑塊形成的作用外，Y2受體還能抑制突觸前的去甲腎上腺素釋放[12]。

本研究結果發現，各組主韌帶、宮骶韌帶組織均有神經肽Y及其Y1、Y2受體的表達。脫垂1、2組主韌帶與宮骶韌帶組織中神經肽Y蛋白陽性表達率低于對照組，說明盆腔臟器脫垂患者主韌帶與宮骶韌帶組織中神經肽Y蛋白呈低表達；脫垂2組主韌帶與宮骶韌帶組織中神經肽Y蛋白陽性表達率低于脫垂1組，說明盆腔臟器脫垂越嚴重其主韌帶與宮骶韌帶組織中神經肽Y蛋白陽性表達率越低。可見，神經肽Y可能參與盆腔臟器脫垂的發生發展。經RT-PCT法檢測發現，脫垂2組主韌帶組織中Y1受體 mRNA表達高于對照組及脫垂1組,而脫垂1組與對照組比較差異無統計學意義；脫垂1、2組宮骶韌帶組織中Y2受體 mRNA表達比較差異無統計學意義，脫垂1組宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達與對照組比較差異無統計學意義，脫垂2組宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達高于對照組。Y1受體在主韌帶、宮骶韌帶組織中表達升高，且盆腔臟器脫垂越嚴重表達越高，說明Y1受體參與盆腔臟器脫垂發生發展。脫垂1、2組主韌帶與宮骶韌帶組織中Y2受體 mRNA表達有升高趨勢，但與對照組比較差異無統計學意義，脫垂1、2組之間比較差異無統計學意義。這可能與本研究樣本小有關。主韌帶組織中Y1受體 mRNA表達與Y2受體 mRNA表達呈正相關，宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達與Y2受體 mRNA表達無明顯相關性。說明主韌帶組織中兩種受體可能協同參與了疾病的發生發展。此外，由于受體的作用復雜、交互，不能單一分析單個受體的影響。神經肽Y系統只是韌帶中的一小部分，其變化對韌帶的改變及疾病的發生可能有作用，但也是有限的。

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陳霞(E-mail:yiyuan170815@163.com)

2017-08-16)