長鏈非編碼RNA MYU對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

周白云，郭永利，王卓，王文琴

(黔西南州人民醫(yī)院，貴州黔西南州562400)

長鏈非編碼RNA MYU對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

周白云，郭永利，王卓，王文琴

(黔西南州人民醫(yī)院，貴州黔西南州562400)

目的探討長鏈非編碼RNA MYU對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法檢測長鏈非編碼RNA MYU在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，將Hela細(xì)胞株分為：1組：轉(zhuǎn)染對照NC序列；2組：轉(zhuǎn)染MYU siRNA；3組：轉(zhuǎn)染對照pcDNA3.1；4組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MYU過表達(dá)序列。采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞細(xì)胞增殖活力，Western blotting和RT-PCR檢測c-myc、CDK4、CDK6基因mRNA及蛋白的表達(dá)，采用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試驗驗證WDR5與MYU的結(jié)合,染色質(zhì)免疫沉淀試驗檢測組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平。結(jié)果癌組織LncRNA MYU的表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.05)；轉(zhuǎn)染24、48 h,OD值比較，2組低于1組，4組高于3組,P均<0.05；Ki-67陽性細(xì)胞所占百分比比較，1組高于2組，3組低于4組，P均<0.05;c-myc 、CDK4、CDK6 mRNA及蛋白比較，1組高于2組，3組低于4組，P均<0.05；LncRNA MYU與WDR5的富集量高于陰性對照(P<0.05)；H3K4me3水平比較，1組低于2組，3組高于4組，P均<0.05。結(jié)論長鏈非編碼RNA MYU通過募集WDR5抑制c-myc基因啟動子區(qū)H3K4me3，上調(diào)c-myc轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖。

宮頸癌；Hela細(xì)胞；長鏈非編碼RNA MYU；c-myc；WDR5；組蛋白H3賴氨酸4三甲基化

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有多種學(xué)說及機(jī)制，但究其根本原因，癌基因的異常過度轉(zhuǎn)錄及抑癌基因的表達(dá)抑制發(fā)揮著基礎(chǔ)作用，因此尋找新的宮頸癌致病基因，使其作為治療靶點，尤為必要[1]。非編碼RNA的產(chǎn)物是成熟的RNA轉(zhuǎn)錄本，一般認(rèn)為不翻譯成蛋白質(zhì)，分為microRNA、piRNA、tRNA、長鏈非編碼RNA (LncRNA)等幾大類[2～4]。宮頸癌相關(guān)的microRNA研究較為透徹，包括microRNA-99b、microRNA-545等[4]。LncRNA是一類長度超過200 bp的轉(zhuǎn)錄本，同樣具有廣泛的生物學(xué)功能[5，6]及多種調(diào)控反式[7]，然而當(dāng)前關(guān)于宮頸癌相關(guān)的LncRNA卻知之甚少。既往研究發(fā)現(xiàn),LncRNA MYU通過與hnRNP-K結(jié)合，穩(wěn)定細(xì)胞周期調(diào)控激酶CDK6轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展[8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)MYU在宮頸癌組織中高表達(dá)，本研究中我們探討了LncRNA MYU對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞株、試劑及儀器 宮頸癌組織及對應(yīng)癌旁組織20例份均來自于本院收集的樣本，起止時間為2012年2月～2016年5月。Hela細(xì)胞株購自上海中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫，培養(yǎng)基為DMEM basic培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗。siRNA由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成，pcDNA3.1-MYU過表達(dá)質(zhì)粒由上海生工生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，啟動子采用巨細(xì)胞病毒，Lipofectamine 2000TM(Invitrogen公司)，熒光染料SYBR Green (TAKATA公司)，c-myc抗體、CDK4抗體、CDK6抗體、Ki-67抗體、WDR5抗體、組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)抗體(abcam公司)，引物(上海生工生物公司)，protein G(Santa Cruz公司)，細(xì)胞裂解及蛋白提取液(碧云天公司)，CCK8試劑盒(日本同仁公司)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)試劑盒(Millipore公司)，染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)試劑盒(Millipore公司)。熒光定量PCR檢測儀(Bio-Rad公司，CFX96)，Western blotting電泳及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

1.2 組織及細(xì)胞LncRNA MYU、c-myc、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)的檢測 使用TRIzol法提取組織及細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃、30 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min。采用熒光定量PCR檢測基因表達(dá)情況，反應(yīng)條件為92 ℃、3 min預(yù)變性，92 ℃、30 s,58 ℃、10 s(39個循環(huán)),72 ℃、2 min, 4 ℃、10 min。所有操作嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行，采用2-ΔΔCT表示目的基因的相對表達(dá)量。引物序列：MYU：F：5′CTTCAGGCGTGTTTTCCCTG3′；R：5′CGACACCTCCAAGATGCTGA3′；c-myc：F：5′CCCTCCACTCGGAAGGACTA3′；R：5′GCTGGTGCATTTTCGGTTGT3′；CDK4：F：5′CAGCTGGTCACATGGTGAGG3′；R：5′TTCCTACGGCCCCATACACC3′；CDK6：F：5′TGGTAACTCCTTCCCCAGAGT3′；R：5′CGAAGCGAAGTCCTCAACAC3′；GAPDH：F：5′AATGGGCAGCCGTTAGGAAA3′；R：5′GCGCCCAATACGACCAAATC3′。

1.3 細(xì)胞中c-myc、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，使用RIPA弱型裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30 min后，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，吸取上層蛋白，測量濃度，加入蛋白loading buffer高溫變性。隨后按試劑盒步驟操作。一抗工作濃度為1∶500，相應(yīng)熒光二抗工作濃度為1∶20 000。Odessay軟件對Western blotting膜進(jìn)行曝光掃描后，采用Quantity One軟件分析各蛋白的灰度值，并校正于內(nèi)參GAPDH，以作為各組相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將Hela細(xì)胞株分為：1組：轉(zhuǎn)染對照NC序列；2組：轉(zhuǎn)染MYU siRNA；3組：轉(zhuǎn)染對照pcDNA3.1；4組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MYU過表達(dá)序列。siRNA及過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine 2000TM包裹，細(xì)胞密度約70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)序列，轉(zhuǎn)染前2 h，將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞轉(zhuǎn)染8 h換為10%血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞表型變化。

1.5 細(xì)胞增殖活力檢測 采用CCK-8法及Ki-67染色法。CCK-8法：細(xì)胞種植于96孔板中，干擾/過表達(dá)48 h后，加入CCK-8試劑，置于37 ℃細(xì)胞孵箱孵育1 h，熒光酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度(OD)值。Ki-67染色法：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h后，以4%多聚甲醛固定，Triton-100打孔，隨后按照1∶100的濃度稀釋Ki-67抗體，4 ℃孵育過夜后進(jìn)行熒光二抗染色。高倍鏡下隨機(jī)選擇5個視野，計數(shù)Ki-67染色陽性細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)量，計算其在總細(xì)胞數(shù)量中所占百分比。

1.6 WDR5與MYU結(jié)合的鑒定 采用RIP實驗。嚴(yán)格按照Millipore公司試劑盒說明書操作步驟操作。實驗中分組：WDR5組，IgG組，分別孵育WDR5抗體及IgG。細(xì)胞裂解后，加入檢測抗體，抗體的工作濃度為每反應(yīng)體系8 μg，4 ℃搖床孵育過夜后，室溫復(fù)溫1 h，加入protein G磁珠捕獲復(fù)合體，洗滌buffer洗滌之后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR之后，熒光定量PCR檢測MYU富集于WDR5蛋白上的RNA水平。

1.7 c-myc基因啟動子H3K4me3水平的檢測 采用CHIP實驗。嚴(yán)格按照Millipore公司試劑盒說明書操作步驟操作。細(xì)胞超聲破碎、交聯(lián)之后，加入H3K4me3抗體孵育，4 ℃搖床孵育過夜后，再次磁珠捕獲、提取DNA，PCR檢測c-myc基因啟動子區(qū)H3K4me3水平。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MYU在宮頸癌患者癌組織及癌旁組織的表達(dá)比較 癌組織LncRNA MYU的表達(dá)量為2.35±0.23，癌旁組織為1.12±0.19，兩者比較，P<0.05。

2.2 敲除或過表達(dá)LncRNA MYU對Hela細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染24、48 h,OD值比較，2組低于1組，4組高于3組,P均<0.05。見表1。1、2、3、4組Ki-67陽性細(xì)胞所占百分比分別為52.23%±5.77%、24.39%±4.58%、42.11%±5.24%、72.94%±6.83%，Ki-67陽性細(xì)胞所占百分比比較，1組高于2組，3組低于4組，P均<0.05。

表1 轉(zhuǎn)染0、24、48 h各組細(xì)胞OD值比較

2.3 敲除或過表達(dá)LncRNA MYU對Hela細(xì)胞c-myc、CDK4、CDK6基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響 c-myc、CDK4、CDK6 mRNA及蛋白表達(dá)比較，1組高于2組，3組低于4組，P均<0.05。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞c-myc、CDK4、CDK6基因mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.4 LncRNA MYU與WDR5在Hela細(xì)胞中的結(jié)合情況 WDR5組LncRNA MYU與WDR5的富集量為0.032 0±0.003 1，IgG組為0.001 2±0.000 1，兩組比較，P<0.05。

2.5 敲除或過表達(dá)LncRNA MYU對Hela細(xì)胞c-myc基因啟動子H3K4me3水平變化的影響 1、2、3、4組c-myc基因啟動子H3K4me3水平分別為0.033±0.006、0.078±0.004、0.164±0.011、0.082±0.007，H3K27me3水平比較，1組低于2組，3組高于4組，P均<0.05。

3 討論

宮頸癌是最常見婦科惡性腫瘤，HPV感染是其主要的危險因素。既往研究表明宮頸癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，但是近年隨著環(huán)境、飲食等因素改變，其發(fā)病開始出現(xiàn)年輕化趨勢。

疾病的發(fā)生是外在環(huán)境和內(nèi)在基因異常轉(zhuǎn)錄共同作用的結(jié)果，但是基因的異常轉(zhuǎn)錄扮演著始動角色。過去，研究者認(rèn)為編碼基因才起關(guān)鍵作用，因為編碼基因的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，非編碼基因的產(chǎn)物只是核酸，而蛋白質(zhì)是最終效應(yīng)器，因此，占基因座上絕大部分位置的非編碼基因被認(rèn)為是一片荒漠，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱之為“轉(zhuǎn)錄垃圾”。非編碼RNA分為microRNA、piRNA、tRNA、LncRNA等幾大類別，其中microRNA的相關(guān)研究目前開展的非常廣泛，其主要發(fā)揮抑制作用。既往研究證實，眾多microRNA分子在宮頸癌演進(jìn)中扮演關(guān)鍵角色，例如microRNA-140-5p通過靶向IGF2BP1抑制宮頸癌增殖和轉(zhuǎn)移，miR-143/145與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。

LncRNA是一類長度超過200 bp的轉(zhuǎn)錄本，作為新興的非編碼物質(zhì)，被認(rèn)為具有相較microRNA更為復(fù)雜的作用方式，例如HotAir、Xist等可以與蛋白修飾復(fù)合體互相作用，影響組蛋白H3K27表觀遺傳學(xué)改變，而H19則可以作為分子篩，發(fā)揮類似“海綿作用”吸附microRNA分子，最終影響靶mRNA。LncRNA既可以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，也可以發(fā)揮抑制作用；既可以結(jié)合核酸，也可以結(jié)合蛋白；既可以修飾蛋白質(zhì)，也可以影響mRNA的成熟和穩(wěn)定。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LncRNA MYU在宮頸癌組織中高表達(dá)，提示可能存在生物學(xué)效能。Kawasaki等[8]發(fā)現(xiàn)，LncRNA MYU通過與RNA結(jié)合蛋白hnRNP-K結(jié)合，穩(wěn)定細(xì)胞周期調(diào)控激酶CDK6轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。Ki-67是細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，可對整個細(xì)胞有絲分裂周期的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，其陽性率越高，表明細(xì)胞增殖越活躍。本研究發(fā)現(xiàn)敲除LncRNA MYU之后， Hela細(xì)胞的增殖活力及Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)降低，而在病毒載體過表達(dá)LncRNA MYU之后，Hela細(xì)胞的增殖活力及Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)升高。進(jìn)一步研究證實，敲除LncRNA MYU將下調(diào)c-myc、CDK4、CDK6的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平表達(dá)，而過表達(dá)則上調(diào)其表達(dá)。基因的異常轉(zhuǎn)錄是由染色體的開閉狀態(tài)決定的，開放狀態(tài)的染色體結(jié)構(gòu)利于轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子的結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄，而關(guān)閉狀態(tài)的染色體則限制了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄則受到抑制。組蛋白H3的不同賴氨酸殘基的甲基化狀態(tài)對基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制發(fā)揮不同的作用，H3K4的三甲基化(H3K4me3)、H3k9的三甲基化(H3K9me3)提示基因的轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)，而H3K27的三甲基化(H3K27me3)則提示轉(zhuǎn)錄抑制。通過CHIP實驗，我們發(fā)現(xiàn)LncRNA MYU可以作為表觀遺傳學(xué)的調(diào)控元件，影響H3K4me3，從而影響c-myc基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)CDK4、CDK6，從而促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖。RIP實驗提示，LncRNA MYU與TrxG/MLL復(fù)合體中的WDR5可直接結(jié)合，WDR5是組蛋白H3的重要調(diào)節(jié)因子，通過輔助TrxG/MLL復(fù)合體抑制甲基化H3K4，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。

綜上所述，LncRNA MYU在宮頸癌組織中高表達(dá)，通過與WDR5結(jié)合，募集TrxG/MLL復(fù)合體至組蛋白，改變組蛋白H3的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)，抑制H3K4me3發(fā)生，從而上調(diào)c-myc基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步上調(diào)CDK4、CDK6，發(fā)揮促Hela細(xì)胞增殖的作用。

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2017-08-09)