miR-7-5p靶向調控EGFR對非小細胞肺癌細胞增殖侵襲的影響

劉承一,肇爽,白璐,呂喜英,高東奇,李青山

(承德醫學院附屬醫院,河北承德067000)

miR-7-5p靶向調控EGFR對非小細胞肺癌細胞增殖侵襲的影響

劉承一,肇爽,白璐,呂喜英,高東奇,李青山

(承德醫學院附屬醫院,河北承德067000)

目的探討miR-7-5p是否通過調控表皮生長因子受體(EGFR)的表達而影響人非小細胞肺癌細胞體外增殖和侵襲能力。方法通過雙熒光素酶試驗證明EGFR為miR-7-5p的下游靶基因，用miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR-N.C.(miR-N.C.組)轉染NCI-H1975細胞，并設立空白對照組，采用實時熒光定量PCR法檢測EGFR mRNA，采用Western blotting法檢測EGFR蛋白的表達。然后通過比色法、流式細胞術和Transwell小室法檢測NCI-H1975細胞體外增殖活力和侵襲能力。結果miR-7-5p可通過靶向3′UTR發揮調節作用，降低熒光素酶的表達活性。miR-7-5p組EGFR mRNA及蛋白表達量低于miR-N.C.組(P均<0.05)。轉染后72 h，miR-7-5p組細胞增殖活力比miR-N.C.組降低(P<0.05)。與miR-N.C.組相比，miR-7-5p組NCI-H1975細胞S期所占比例下調(P<0.05)，而G0/G1期細胞所占比例增加(P<0.05)。與miR-N.C組相比，miR-7-5p組細胞侵襲變化率下調(P<0.05)。結論miR-7-5p通過靶向抑制EGFR的表達而抑制人非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲能力。

非小細胞肺癌；微小RNA-7-5p；表皮生長因子受體；細胞增殖；細胞侵襲

肺癌中約85%患者為非小細胞肺癌[1]，隨著人口老齡化增加，65歲以上的老齡肺癌患者占比超過2/3[2]。由于診治不及時或缺乏有效早期診斷等原因，部分患者已失去手術機會，因而尋求非手術治療方法成為惟一選擇。因表皮生長因子受體(EGFR)在實體腫瘤疾病進展中有重要作用[3]，已有針對EGFR的單克隆抗體研發，雖在使用過程中顯現出相應療效，但其耐藥問題較為突出[4]，因此需要探索更積極有效的靶向EGFR的治療策略。2016年1～12月,本研究擬在人非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975中證實微小RNA-7-5p (miR-7-5p)對EGFR的靶向負性調控作用，并探討其對NCI-H1975細胞增殖活力和侵襲能力的影響，為針對EGFR的靶向策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 293T細胞和人非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975購于中國科學院，NCI-H1975細胞培養于高糖DMEM中，其中含有1%鏈霉素、青霉素和10%胎牛血清。293T細胞培養于含10%小牛血清DMEM培養基中，培養條件為37 ℃、5% CO2、100%相對飽和濕度，常規培養、傳代。胎牛血清購于美國Gibco公司,鏈霉素和青霉素、胰蛋白酶購于HyClone公司，DMEM高糖培養基、細胞裂解液、MTS細胞增殖檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，miR-7-5p及其陰性對照(miR-N.C.)購于上海吉瑪公司；TRIzol試劑、PCR引物和脂質體Lipo2000TM購于Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于TAKARA公司，EGFR抗體及HRP標記二抗購于Santa Cruz公司，雙熒光素酶檢測報告系統試劑盒購于Promega公司。

1.2 miR-7-5p對EGFR靶向作用的驗證 采用熒光素酶試驗。以1×106/孔將293T細胞鋪板于6孔板中，培養24 h后，按照以下分組進行轉染，共轉染分組分別為pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-7-5p、pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-N.C.、pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm/miR-7-5p、pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm/ miR-N.C.組。pMIR-report-3′UTR為表達螢火蟲熒光素酶的非突變質粒載體，pMIR-report-3′UTRm為其對照，是不表達螢火蟲熒光素酶的突變質粒載體，pRL-TK質粒表達海腎熒光素酶。293T細胞共轉染48 h后，用細胞裂解液將細胞裂解，按照說明書提示，依次加入stop/glo和LARⅡ，分別用于檢測海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，所得OD值按照如下公式處理：相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性×100%。

1.3 EGFR mRNA及蛋白的檢測 以1×106/孔將NCI-H1975細胞鋪板于6孔板中，培養24 h后，參照Lipo2000TM說明書進行共轉染或轉染操作，NCI-H1975細胞被轉染miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR-N.C.(miR-N.C.組)，采用實時熒光定量PCR法檢測EGFR mRNA。NCI-H1975細胞轉染48 h后，用TRIzol試劑裂解各組細胞，提取總mRNA，使用TOYOBO公司的逆轉錄試劑盒，參照說明書操作，逆轉錄得到cDNA后，進行實時熒光定量PCR擴增檢測，ABI7300設置條件為：酶激活3 min(95 ℃)，變性2 s(95 ℃)，延伸30 s(60 ℃)，反應40個循環后擴增終止。用2-ΔΔCt法[5]表示目的基因相對表達量。采用Western blotting法檢測EGFR蛋白。使用細胞裂解液提取轉染后的NCI-H1975細胞總蛋白，總蛋白經BCA法測定濃度后，以30 μg/孔加樣，經10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，將轉印了蛋白的聚偏二氟乙烯膜用5%脫脂牛奶封閉，并培育EGFR及相應的HRP標記二抗，ECL化學發光法顯影。使用Quantityone軟件測定條帶灰度值，蛋白的相對含量=目的蛋白條帶灰度值/內參照條帶灰度值。

1.4 細胞增殖活力的檢測 采用細胞增殖試驗(比色法)。將轉染了miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR- N.C.(miR- N.C.組)48 h后的NCI-H1975細胞及未處理的NCI-H1975細胞(空白對照組)用胰蛋白酶消化、重懸后，在96孔板中按照1 000個/孔細胞密度接種，并于鋪板后的4、12、24、48、72 h觀察細胞增殖情況，在450 nm波長處測定加入MTS試劑后上清液中的吸光度(A值)。

1.5 細胞周期的檢測 采用流式細胞術。將轉染了miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR- N.C.(miR- N.C.組)48 h后的NCI-H1975細胞及未處理的NCI-H1975細胞(空白對照組)經胰蛋白酶消化、重懸后，用70%冰乙醇固定24 h，采用流式細胞儀對propidium iodide染色后的細胞進行檢測，使用CELL Quest(Version 3.4, 美國B&D公司)軟件分析所得結果數據。

1.6 細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell小室法。用胰蛋白酶將轉染48 h后的NCI-H1975細胞消化，并用含0.2%胎牛血清的DMEM重懸，經臺盼藍染色鑒定細胞存活率為95%以上。以5×105/孔分別將miR-7-5p轉染細胞(miR-7-5p組)、miR-N.C.轉染細胞(miR-N.C.)和未處理細胞(空白對照組)接種于Transwell的上室中，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM，培養24 h后，對侵襲并穿透基質膠的NCI-H1975細胞進行染色和脫色，測定560 nm波長處A值。細胞侵襲變化率=∣對照組A值-試驗組A值∣/對照組A值×100%。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料用中位數表示，3組間比較采用Wilcoxon Kruskall-WallisH檢驗，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-7-5p對EGFR靶向作用的驗證結果 miR-7-5p可通過靶向3′端非翻譯區(3′UTR)發揮調節作用，降低熒光素酶的表達活性，而無功能的miR-N.C.未體現此效應(70.6% 比100%，χ2=28.3，P<0.01)。此外，3′UTR調節位點突變后的pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm，加入miR-7-5p處理后，其相對熒光素酶活性亦無變化(100%比100%，P>0.05)。

2.2 miR-7-5p對NCI-H1975細胞EGFR mRNA和蛋白表達的抑制作用 miR-7-5p組NCI-H1975細胞中EGFR mRNA表達水平為0.22、EGFR 的蛋白水平為0.30， miR-N.C.組的EGFR mRNA表達水平為1.13，EGFR 蛋白水平為1.08，兩組EGFR mRNA及蛋白比較，P均<0.05。

2.3 miR-7-5p對NCI-H1975細胞增殖活力的影響 轉染后72 h，miR-7-5p組NCI-H1975細胞的增殖活力比miR-N.C.組低(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間各組NCI-H1975細胞增殖活力比較

2.4 miR-7-5p對NCI-H1975細胞周期的影響 與miR-N.C.組相比，miR-7-5p組NCI-H1975細胞S期所占比例下調(P<0.05)，而G0/G1期細胞所占比例增加(P<0.05)。見表2。

2.5 miR-7-5p對NCI-H1975細胞侵襲能力的影響 空白對照組細胞侵襲變化率為99.6%，miR-7-5p組為51.4%，miR-N.C組為99.2%。與miR-N.C組相比，miR-7-5p組細胞侵襲變化率下調48.8%(P<0.05)。

表2 各組不同時期細胞所占比例比較

3 討論

miRNA是一種天然存在于細胞內的非編碼小RNA分子，由21～24個核苷酸構成。它在翻譯階段，通過不完全堿基配對方式，靶向識別并結合到mRNA上特異的結合位點，從而引起mRNA降解或翻譯抑制，最終導致功能蛋白表達減少[6]。miRNA的結合位點通常位于mRNA的3′UTR，人體中受miRNA調控的基因約有92%[7]，針對miRNA在腫瘤進展中作用的研究也逐漸成為熱點[8]。

生物信息學分析發現，翻譯表達EGFR的mRNA上可能存在miR-7-5p的靶向結合位點，同時，近年研究顯示，miR-7-5p可靶向抑制腦膠質細胞瘤[9]和胃癌[10]中EGFR的蛋白表達。本研究中，我們也觀察到miR-7-5p針對3′UTR位點的靶向作用，而突變該位點時，miR-7-5p的負向調控效應消失；檢測轉染了miR-7-5p的NCI-H1975細胞中EGFR的表達，發現其在核酸水平和蛋白水平的表達均降低。分析其原因，miR-7-5p除了可以抑制EGFR mRNA向蛋白翻譯的進程外，對mRNA本身也起到了降解作用。

我們進一步探究了miR-7-5p對NCI-H1975細胞增殖活力的影響，發現隨著miR-7-5p作用時間的延長，處理后的NCI-H1975細胞增殖活力逐步減弱，細胞周期阻滯于G0/G1期。目前研究認為，原癌基因c-erbB-1的表達產物之一即為EGFR[11]，EGFR具有酪氨酸激酶活性，當其與相應受體結合后，激活胞內酪氨酸殘基磷酸化，通過介導細胞信號轉導從而加快了血管生成、細胞分化等進程[12]，這些細胞進程亦是腫瘤進展中的關鍵推動環節，可見EGFR在其中發揮了重要作用。本研究結果反向證實了這一觀點，當miR-7-5p靶向抑制EGFR的表達時，NCI-H1975細胞增殖活力受抑制。由于miR-7-5p可靶向調節EGFR的表達，也可能同時影響了其他增殖相關蛋白的表達，從而發揮了協同效應。EGFR在體外試驗中表現出對喉癌細胞、乳腺癌細胞的侵襲能力具有促進作用，當miR-7-5p靶向下調EGFR的表達時，乳腺癌細胞的侵襲能力受到抑制。本研究中，我們也觀察到，用miR-7-5p處理NCI-H1975細胞后，細胞的侵襲能力較對照組下降。惡性腫瘤的重要生物學特征之一是腫瘤細胞向周圍組織的侵襲，這也是腫瘤晚期的事件之一，常導致患者病情惡化、進展甚至死亡[13]。

總之，本研究證實了miR-7-5p可從核酸水平和蛋白水平實現對EGFR表達的抑制，并進一步證實miR-7-5p可抑制人非小細胞肺癌細胞株的增殖活力和侵襲能力，這為針對EGFR的非小細胞肺癌基因治療策略提供了參考。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.011

R734.2

A

1002-266X(2017)45-0036-03

李青山(E-mail:236467677@qq.com)

2017-08-18)