不同劑量X線照射對大鼠卵巢功能的影響

王雪芹,張永峰,劉淑華,張淑嫻,徐愛霞

(濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊261031)

不同劑量X線照射對大鼠卵巢功能的影響

王雪芹,張永峰,劉淑華,張淑嫻,徐愛霞

(濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊261031)

目的探討不同劑量X線照射對大鼠卵巢功能的影響。方法將60只Wistar大鼠隨機分為對照組、G0.1組、G1.0組、G10.0組，分別采用0、0.1、1.0、10.0 Gy X線外照射，于照射后1 h、5 d(1個動情周期)、10 d(2個動情周期)，分別應用免疫組化SABC法、免疫放射法檢測不同劑量X線照射不同時間后Wistar大鼠在不同動物周期中卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白的表達水平及生殖激素雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的水平；并比較各組上述指標。結果X線照射后1 h，各組各級卵泡數目及各激素水平比較，P均>0.05。X線照射后5 d，與對照組比較， G0.1組各級卵泡數目升高，血清FSH降低、LH及E2升高；G1.0、G10.0組各級卵泡數目減少，血清FSH升高、LH及E2降低(P均<0.05)；X線照射后10 d，G10.0組各級卵泡數目減少，血清FSH升高、LH及E2降低(P均<0.05)。與其余組比較，G10.0組X線照射5、10 d各級卵泡數目減少，血清FSH升高，LH及E2降低(P均<0.05)。與同組內照射后1 h比較，照射后5 d，G0.1組各級卵泡數目升高，血清FSH降低、LH及E2升高(P均<0.05)，照射后10 d，均恢復至正常水平；G1.0組照射后5 d各級卵泡數目降低，血清FSH升高、LH及E2降低(P均<0.05)，照射后10 d恢復至正常水平； G10.0組照射后5 、10 d各級卵泡數目均降低，血清FSH升高、LH及E2降低(P均<0.05)。與照射后1 h比較，G0.1組照射后5 d Bcl-2陽性表達率升高，G1.0組照射后5 d 降低，G10.0組照射后5、10 d均降低(P均<0.05)。結論低劑量X線照射可一定程度抑制細胞凋亡，避免卵巢損傷；當照射劑量超過一定值(≥1.0 Gy)，卵巢功能受損，但損傷是可逆的；當給予超大劑量(10.0 Gy)照射后，卵巢功能嚴重損傷，甚至出現不可逆性早衰。

卵巢功能；X線電離輻射；X線輻射劑量;卵泡；細胞凋亡；生殖激素；大鼠

X線在醫療領域為人類健康發揮越來越重要作用，但其伴隨的電離輻射對機體的危害不容忽視。不孕不育癥的常規檢查方法——子宮輸卵管造影(HSG)中的X 線電離輻射對卵巢的損傷引起醫療專家關注。2014年6月～2016年6月，本實驗通過觀察HSG中不同X線照射劑量照射大鼠后其生殖激素變化及顆粒細胞凋亡抑制基因Bcl-2的表達，以探討不同X線輻射劑量對卵巢功能的影響，以期為保護卵巢、優生優育提供更多實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級Wistar大鼠60只，2～3周齡，體質量(100±6.8)g,由山東魯抗醫藥有限公司實驗動物中心提供，合格證號SCXR魯20130001，在溫度(23±2)℃、相對濕度40%～70%環境下分籠飼養。籠具、墊料、飲用水和飼料均按試驗要求標準方法準備，大鼠自主飲食。試劑與藥物：促性素孕馬血清由杭州動物藥品廠提供；100 g/L水合氯醛由濰坊市人民醫院提供；Bcl-2試劑盒及PV-9000通用型kit購自北京中山生物科技公司。西門子數字化平板機購自德國西門子公司。

1.2 分組及處理 將60只Wistar大鼠隨機分為4組，每組為15只，給予不同照射量X線，管電壓72 V，靶皮距100 mm，管電流為20 mAs。對照組不接受X線照射，放置檢查室時間基本等同于G0.1組的照射時間； G0.1組接受放射線照射劑量為0.1 Gy； G1.0組接受X線照射劑量為1.0 Gy；G10.0組接受X線照射劑量為10.0 Gy。分別于照射后1 h、5 d(1個動情周期)、10 d(2個動情周期)后，隨機選取5只大鼠，給予水合氯醛0.7～1.0 mL進行腹腔注射麻醉，碘伏消毒，通過心包穿刺取血，離心、分離血清，-20 ℃保存。分別于照射后1 h，5、10 d，用4%戊巴比妥鈉0.7～1.5 mL行腹腔注射麻醉，卵巢按橫軸方向在最大徑處縱向剖開，皮膚清潔消毒后取雙側卵巢，去除周圍脂肪，生理鹽水沖洗。組織放入甲醛中固定，常規脫水，石蠟包埋。所有石蠟組織塊行4 μm連續切片，載玻片經APES處理。

1.3 卵泡數目的觀察 從切片中隨機取出1張做HE染色，顯微鏡下觀察卵泡，在(40×10)光鏡下對各級卵泡進行計數，觀察始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡的數目變化。

1.4 細胞Bcl-2蛋白表達的檢測 采用免疫組化SABC法。切片脫蠟后用PBS進行水化，然后進行抗原修復并加入一抗，用PBS沖洗，加入二抗培養后用SABC法進行染色，光鏡下根據各細胞特點，區分出顆粒細胞，觀察顆粒細胞中Bcl-2蛋白表達情況。按細胞有無顯色或顯色深淺計分：無顯色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；按顯色細胞比例計分：顯色細胞<1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～100%計3分。根據陽性細胞染色深淺和陽性細胞占顆粒細胞總數的百分數進行計分，以兩者計分的乘積作為最終判斷標準：0為陰性；1～4為弱陽性；6為陽性；9為強陽性；≥6為高表達，<6為低表達或不表達。

1.5 大鼠血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)水平的檢測 采用免疫放射法。按照放射免疫分析檢測試劑盒說明書步驟檢測血清E2、FSH、LH水平。

2 結果

2.1 各組不同時間卵巢卵泡數目比較 X線照射后1 h，各組各級卵泡數目比較，P均>0.05。X線照射后5 d，與對照組比較，G0.1組各級卵泡數目升高，G1.0、G10.0組各級卵泡數目減少(P均<0.05)；X線照射后10 d，G10.0組各級卵泡數目減少(P均<0.05)。與其余組比較，G10.0組X線照射5、10 d各級卵泡數目減少(P均<0.05)。與同組內照射后1 h比較，照射后5 d，G0.1組各級卵泡數目升高(P均<0.05)，照射后10 d降低至正常水平；G1.0組照射后5 d各級卵泡數目降低(P均<0.05)，照射后10 d升高至正常水平；G10.0組照射后5 、10 d各級卵泡數目均降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間各級卵泡數目比較 (個

2.2 各組不同時間顆粒細胞Bcl-2表達比較 照射后1 h、5 d、10 d，對照組顆粒細胞Bcl-2陽性表達率分別為60.0%、80.0%、60.0%，不同時間比較差異無統計學意義(P>0.05)；G0.1組顆粒細胞Bcl-2陽性表達率分別為60.0%、100.0%、66.7%，與照射后1 h比較，照射后5 d陽性表達率升高(P<0.05)，10 d差異無統計學意義(P>0.05)；G1.0組顆粒細胞Bcl-2陽性表達率分別為60.0%、30.0%、53.3%，照射后5 d Bcl-2陽性表達率降低(P<0.05)，10 d差異無統計學意義(P>0.05)；G10.0組顆粒細胞Bcl-2陽性表達率分別為60.0%、10.0%、10.0%，照射后5、10 d Bcl-2陽性表達率均降低(P均<0.05)。

2.3 各組不同時間血清FSH、LH、E2水平比較 X線照射后1 h，各組血清E2、FSH、LH水平比較，P均>0.05。照射后5 d，與對照組比較，G0.1組血清FSH降低，LH及E2升高；G1.0 組及G10.0組血清FSH升高，LH及E2降低(P均<0.05)；X線照射后10 d，G10.0組血清FSH升高，LH及E2降低(P均<0.05)。與其余組比較，G10.0組X線照射5、10 d，血清FSH升高，LH及E2降低(P均<0.05)。與同組內照射后1 h比較，G0.1組照射后5 d FSH降低，LH及E2升高(P均<0.05)，照射后10 d，恢復至正常水平；G1.0組照射后5 d FSH升高，LH及E2降低(P均<0.05)，照射后10 d恢復至正常水平；G10.0組照射后5、10 d FSH升高，LH及E2降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間血清FSH、LH、E2水平比較

3 討論

目前研究證明，卵巢中的卵泡細胞、顆粒細胞對X線照射尤其敏感[1]，卵原細胞通過增殖和分化形成初級卵母細胞，初級卵母細胞經過減數第一次分裂形成次級卵母細胞，次級卵母細胞減數第二次分裂形成卵細胞，該過程中若受到一定量電離輻射，卵巢中卵泡數目將減少，同時顆粒細胞也會發生凋亡，更促使卵泡閉鎖，影響卵巢分泌功能，導致卵巢不同程度可逆或不可逆損傷，嚴重影響優生優育[2,3]。本研究結果顯示，極低劑量X線照射(本實驗為0.10 Gy)不僅不會對卵巢產生危害，反而會一過性刺激卵巢及機體產生應激，Bcl-2表達一過性增強，生殖激素也產生類似的正應激，抑制細胞凋亡，保護卵巢免受危害。該結果提示極低劑量X線輻射可能會促使機體發生應激性反應，對卵巢不會產生損害，我們后續研究會針對該結果進行進一步實驗驗證。

Bcl-2基因是目前研究較廣泛的一種抑制細胞凋亡的基因。Bcl-2蛋白是細胞凋亡的敏感性指標，它可以抑制由多種細胞毒因素所引起的細胞死亡，Bcl-2的過度表達能增強所觀察細胞對大多數細胞毒素的抵抗性，在走向凋亡的細胞中低表達或不表達[4～6]。本研究結果是超過一定劑量X線照射后，卵泡顆粒細胞Bcl-2表達降低，細胞凋亡增加，與目前大多數研究結果相符。大量凋亡顆粒細胞中Bcl-2呈低表達或不表達，Bcl-2基因對于卵泡細胞、顆粒細胞凋亡具有很重要的調控作用。本研究發現，X線照射劑量為0.1 Gy時卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白表達水平應激性升高，一定程度上抑制顆粒細胞凋亡；照射劑量為1.0 Gy，顆粒細胞Bcl-2蛋白表達水平降低，從而可使顆粒細胞周期性調解停滯，顆粒細胞發育停滯，卵巢出現早衰。

卵巢的產卵及分泌功能受大腦皮質、下丘腦、垂體及內部調節因素的共同影響，卵泡的發育調控與生殖激素相互影響協同調節[7]，如雌激素、孕激素、FSH、LH等。一方面，卵泡在FSH和雌激素的共同參與下逐步發育成熟，雌激素漸入高峰，達峰值后對垂體產生正反饋，使垂體分泌大量的FSH和LH，促使排卵。另一方面，LH可刺激卵泡壁中內膜細胞分泌大量的睪酮，睪酮通過基底膜到達顆粒細胞，作為合成E2的主要前體物質，通過FSH與顆粒細胞受體結合共同將雄激素轉化為E2[8]，促進卵泡正常發育。本研究結果提示，經過1.0 Gy X線照射后卵巢中顆粒細胞凋亡增加，FSH與顆粒細胞上的FSH受體無法結合從而不能將雄激素轉化為E2，體內E2水平下降；另外，不能正反饋作用于下丘腦，使LH水平降低，進一步使卵母細胞成熟抑制素水平升高，從而影響卵母細胞正常發育，最終導致排卵功能下降，甚至導致卵巢產生不可逆性損害[9]。

通過連續分析不同生理周期各觀察指標的變化，本研究發現，X線照射后1 h，各組中卵巢Bcl-2蛋白表達及激素水平差異均無統計學意義；說明電離輻射對機體危害產生需要一個變化過程，機體損害無法即時表達。這與Suzuki等[10]研究相一致。低劑量X線輻射(本研究為≤0.1 Gy)第1個動物周期Bcl-2蛋白表達先上調后恢復；FSH短暫降低，LH及E2一過性升高，說明低劑量X線輻射對卵巢未產生明顯損傷，反而會刺激卵巢顆粒細胞凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達增強，從而一定程度抑制細胞凋亡，避免卵巢損傷，與以往研究結果不同，可能與自身適應或保護有關。當照射劑量超過一定值(本研究為≥1.0 Gy)，電離輻射使Bcl-2蛋白表達降低，顆粒細胞凋亡增加；FSH 升高，E2及LH降低。這種損傷在第1個動物生理周期損傷達高峰，第2生理周期所致損傷明顯恢復，說明該照射劑量下會使卵巢卵泡及顆粒細胞凋亡增加，卵巢功能受損，但損傷是可逆的；當給予超大劑量(本研究為10.0 Gy)照射后，Bcl-2蛋白表達明顯降低，FSH升高顯著，且在第2個動物周期變化無明顯恢復，說明卵巢產生嚴重損傷，甚至發生不可逆性早衰。因此，育齡期婦女在做HCG或其他放射線檢查時，降低照射劑量、做好防護措施，對保護卵巢、優生優育至關重要。

總結國內外相關研究，個人認為目前有以下幾個問題有待解決[2～5]：①人類HSG中常規劑量X 線照射對卵巢細胞及卵巢功能是否有影響；②不產生卵巢損傷的最大X線劑量為多少，低劑量X線照射產生抑制卵巢凋亡的原理；③是否具有遺傳效應，產生遺傳效應的最少劑量為多少； ④目前研究多數屬于動物實驗，如何進行動物-人之間的照射劑量的合理轉換；⑤X線照射后卵巢組織及分泌功能改變、病理組織檢查及卵泡發育相關基因綜合分析判斷卵巢損傷情況。以上問題我們將在后續研究中不斷跟進，進行大標本動物實驗，延長觀察周期及時間點，進行更深入的相關研究。

[1] Jang H, Hong K, Choi Y. Melatonin and fertoprotective adjuvants: prevention against premature ovarian failure during chemotherapy[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(6):1221.

[2] Aktas C, Kanter M, Kocak Z. Antiapoptotic and proliferative activity of curcumin on ovarian follicles in mice exposed to whole body ionizing radiation[J]. Toxicol Ind Health, 2012,28(9):852-863.

[3] Teng PN, Bateman NW, Darcy KM, et al. Pharmacologic inhibition of ATR and ATM offers clinically important distinctions to enhancing platinum or radiation response in ovarian, endometrial, and cervical cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2015,136 (3):554-561.

[4] Yang YB, Wang S, Li S, et al. Effects of compound Daqiqi decoction combined cisplatin on Bcl-2/Bax expression of nude mice ovarian cancer subcutaneous transplanted tumor[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2015,40 (8):1575-1579.

[5] 孫佳星，蔡愛露.低頻超聲聯合載順鉑超聲微泡造影劑對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響[J].山東醫藥，2017，57(8)：44-46.

[6] Vaithiyanathan K, Liew SH, Zerafa N, et al. BCL2-modifying factor promotes germ cell loss during murine oogenesis[J]. Reproduction, 2016,151(5):553-562.

[7] Togrul C, Balsak D, Ekinci C, et al. Effects of potentilla fulgens as a prophylactic agent for ischemia/reperfusion injury in the rat ovary[J]. Anal Quant Cytopathol Histpathol, 2015, 37(5):310-316.

[8] Sánchez F, Romero S, Albuz FK, et al. In vitro follicle growth under non-attachment conditions and decreased FSH levels reduces Lhcgr expression in cumulus cells and promotes oocyte developmental competence[J]. J Assist Reprod Genet, 2012,29(2):141-152.

[9] Rinaldi VD, Hsieh K, Munroe R, et al. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death[J]. Genetics, 2017,206(4):1823-1828.

[10] Suzuki K, Kodama S, Watanabe M. Role of Ku80-dependent end-joining in delayed genomic instability in mammalian cells surviving ionizing radiation[J]. Mutat Res, 2010,683(1-2):29-34.

EffectsofdifferentX-raydosesontheovarianfunctionofrats

WANGXueqin,ZHANGYongfeng,LIUShuhua,ZHANGShuxian,XUAixia

(TheAffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261031,China)

ObjectiveTo observe the effects of different X-ray doses on the ovarian function of rats.MethodsSixty Wistar rats were randomly divided into four groups : the control group, G0.1 group, G1.0 group and G10.0 group, with different X-ray doses (0, 0.1, 1.0, and 10.0 Gy). At 1 h, 5 d (an estrous cycle), 10 d (two estrous cycles) after exposure, the expression levels of the Bcl-2 protein, the E2, FSH, and LH in the ovarian granulosa cells of Wistar rats in different animal cycles after different X-ray doses were observed by immunohistochemistry and immunoradiometry, and then we compared the above indicators.ResultsAt 1 h after X-ray radiation, no significant difference was found in the number of follicles and the level of each hormone between groups (allP>0.05). At 5 d after X-ray radiation, the number of follicles increased, the serum FSH decreased and the levels of LH and E2increased in the G0.1 group as compared with those of the control group; the number of follicles decreased, the serum FSH increased and the levels of LH and E2decreased in the G1.0 and G10.0 groups (allP<0.05). At 10 d after X-ray radiation, the number of follicles at all levels decreased, serum FSH increased, and LH and E2decreased in the G10.0 group (allP<0.05). Compared with the other groups, the number of follicles decreased, FSH increased, and LH and E2decreased in the G10.0 group at 5 and 10 d after X-ray radiation (allP<0.05). At 5 d after X-ray radiation, the number of follicles increased, the serum FSH decreased, and LH and E2increased in the G0.1 group as compared with that at 1 h (allP<0.05), and they all returned to the normal levels at 10 d (P<0.05); at 5 d after X-ray radiation, the number of follicles decreased, the serum FSH increased, and LH and E2decreased in the G1.0 group as compared with that at 1 h (allP<0.05), and they all returned to the normal levels at 10 d (P<0.05); at 5 and 10 d after X-ray radiation, the number of follicles decreased, the serum FSH increased, and LH and E2decreased in the G10.0 group (allP<0.05). The positive rate of Bcl-2 in the G0.1 group increased at 5 d after X-ray radiation, decreased in the G1.0 group at 5 d after X-ray radiation, and decreased in the G10.0 group at 5 and 10 d after X-ray radiation (allP<0.05).ConclusionsLow-dose X-ray radiation can inhibit the apoptosis to a certain extent, and avoid the ovarian injury. When the radiation dose exceeds a certain value (greater than 1.0 Gy), the ovarian function is impaired, but the damage is reversible.When the oversize dose (10.0 Gy) is given, the ovarian function is severely damaged, even with irreversible premature aging.

ovarian function; ionizing radiation; follicles; apoptosis; reproductive hormone; rat

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.007

R271

A

1002-266X(2017)45-0024-04

山東省醫藥衛生科技發展基金項目(2013WS0294);濰坊市科技局軟科學基金項目(2012RKX006)。

王雪芹(1976-)，女，副主任醫師，主要研究方向為腫瘤及生殖影像診斷。 E-mail:xuE20050415@163.com

張永峰(1975-),男，副主任醫師，主要研究方向為新生兒疾病及兒童神經系統疾病。E-mail:zy20050415@163.com

2017-08-16)