銅綠假單胞菌注射液對肺癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

鄢俊，鐘志宏，施華球

(1贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州341000；2贛南醫學院社區醫學教育研究中心)

銅綠假單胞菌注射液對肺癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

鄢俊1，鐘志宏2，施華球1

(1贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州341000；2贛南醫學院社區醫學教育研究中心)

目的探討銅綠假單胞菌(PA)注射液對肺癌細胞增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法選擇肺癌細胞株NCI-H1395和95-D接種于96孔板，分別設對照組和觀察1、2、3組，分別加入0、0.25×109/mL、0.5×109/mL、1×109/mL的PA注射液培養 24 h。另設對照組、PA組和AG1478組，對照組不加藥，PA組加入1×109/mL的PA，AG1478組加入1×109/mL的PA和10-7mol/L的表皮生長因子受體抑制劑AG1478。采用MTT法觀察各組細胞增殖情況；AnnexinV/PI雙染試驗檢測各組細胞凋亡率。結果隨著PA濃度的升高，肺癌NCI-H1395和95-D細胞OD570不斷降低，細胞凋亡率不斷升高(P均<0.05 )。與對照組相比，PA組細胞OD570降低(P<0.05)，細胞凋亡率升高(P<0.05)；與PA組相比，AG1478組細胞OD570升高，細胞凋亡率降低(P均<0.05)。結論PA注射液通過EGFR信號通路抑制肺癌細胞NCI-H1395和95-D增殖，促進其凋亡。

肺腫瘤；銅綠假單胞菌注射液；細胞增殖;細胞凋亡；表皮生長因子受體

近年許多國家肺癌的發病率和病死率均明顯增加，對肺癌的預防和治療已不容忽視[1，2]。表皮生長因子受體(EGFR)具有酪氨酸激酶活性，其與表皮生長因子結合后，啟動細胞核內有關基因,促進細胞增殖。EGFR在許多癌癥中均高表達，如胃癌[3]、膀胱癌[4]和乳腺癌[5]等，許多腫瘤中EGFR的過表達或突變與腫瘤發生發展及預后密切相關[6]。銅綠假單胞菌(PA)注射液可以提高機體免疫力。給正常小鼠注射PA注射液后，小鼠的免疫力增強[7],在荷瘤小鼠中，PA注射液可以維持T輔助細胞與T抑制細胞比值在正常范圍內，提高巨噬細胞和NK細胞的活性，提高感染變形桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌和肺炎桿菌小鼠的存活率[8，9]。研究表明，PA注射液能直接殺傷胃癌瘤株MKN45，對胃癌瘤株具有抑制增殖和誘導凋亡的作用，其可有效預防胃癌患者術后近期腹腔復發和轉移，并增強免疫力[10]。目前PA注射液對肺癌作用的研究甚少。2016年12月～2017年3月，本研究探討了PA注射液對肺癌細胞NCI-H1395和95-D增殖、凋亡的影響，并探討EGFR在其中發揮的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞NCI-H1395和高轉移的肺癌細胞95-D購于中國科學院上海細胞庫，培養于10%胎牛血清+1%抗生素的 DMEM培養液中，培養條件為5% CO2、相對濕度95%、37 ℃。PA注射液(規格0.5 mL,PA濃度2.0×109/mL)，DMSO(Sigma 公司，美國)，標準胎牛血清、DMEM 培養液(Gibco公司，美國)，MTT 試劑盒(Invitrogen 公司，美國),Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒、DAPI 染色試劑盒和蛋白提取試劑盒 (南京凱基生物技術公司,中國 )，AKT抗體、ERK抗體、EGFR抗體、p-AKT抗體、p-ERK抗體、p-EGFR抗體和GAPDH抗體(Abcam公司，美國)。

1.2 細胞分組與處理 取處于對數生長期的肺癌NCI-H1395和95-D細胞，胰酶消化后用10% FBS的 DMEM 培養液制成細胞懸液，以3×103/孔的細胞密度接種于 96 孔培養板后放于CO2培養箱中培養至細胞貼壁，加入無血清的DMEM培養液饑餓24 h。設對照組和觀察1、2、3組，每組5孔，分別加入0、0.25×109/mL、0.5×109/mL、1×109/mL的PA注射液培養 24 h;另設對照組、PA組和AG1478組，每組5孔。對照組不加藥正常培養，PA組加入1×109/mL的PA，AG1478組加入1×109/mL的PA和10-7mol/L 的AG1478培養24 h。

1.3 各組細胞增殖活力檢測 采用MTT法。每孔加入MTT 5 μL，放于CO2培養箱中培養4 h后棄掉培養液。每孔加入MTT 100 μL，搖床上充分混勻后。酶標儀(Bio-Tek,ELX800)選擇570 nm 波長進行檢測，記錄各孔的 OD 值(OD570)。

1.4 各組細胞凋亡率測算 采用AnnexinV/PI雙染法。各組細胞棄掉培養液，用胰蛋白酶消化后，2 000 r/min離心5 min，收集細胞。用 PBS 洗滌細胞2次后計數,取5×105個細胞于1.5 μL的EP管中，分別向每個EP管中加入 Binding Buffer 500 μL懸浮細胞，再加入Annexin V-FITC 5 μL渦旋混勻后，最后加入Propidium Iodide 5 μL渦旋混勻。 室溫、避光、反應 15 min。上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2 結果

2.1 PA注射液對肺癌細胞增殖活力及凋亡率的影響 隨著PA濃度的升高，肺癌NCI-H1395和95-D細胞OD570不斷降低(P均<0.05 )，細胞凋亡率不斷升高(P均<0.05 )。見表1。

表1 各組細胞OD570及凋亡率比較

注：與對照組相比，aP<0.05;與觀察1組相比，bP<0.05;與觀察2組相比，cP<0.05。

2.2 AG1478對PA培養的肺癌細胞增殖活力、凋亡的影響 與對照組相比，PA組OD570降低，細胞凋亡率升高(P均<0.05)；與PA組相比，AG1478組OD570升高，細胞凋亡率降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞OD570、凋亡率比較

注：與對照組相比，*P<0.05;與PA組相比，#P<0.05。

3 討論

有研究結果表明, 甘露糖是細胞膜糖基化的核心結構，而這種結構的改變是肺癌腫瘤復發與轉移的重要基礎[11]。PA注射液是以基因工程作為技術手段，以綠膿桿菌作為載體,而制備出的全身被甘露糖敏感性菌毛密布的制劑, 腫瘤細胞表面的甘露糖與甘露糖敏感性菌毛上的甘露糖結合蛋白發生特異性結合后誘導腫瘤細胞發生凋亡，通過改變腫瘤細胞的生物學行為而發揮其抗腫瘤作用[12]。另一方面二者結合后癌細胞的抗原信號被放大，被放大的抗原信號刺激抗原遞呈細胞,幫助重建免疫監視功能,避免腫瘤細胞發生免疫逃逸，從而阻止腫瘤細胞的增殖和轉移[13]。

研究表明，用PA注射液進行膀胱癌術后的干預,可使膀胱癌的復發率降低[14]。胃癌術后腹水及惡性體腔積液的患者經PA注射液治療后，患者的中位生存期顯著延長，免疫學指標改善[15]。本研究結果顯示，隨著PA濃度的增加，各組OD570不斷降低，細胞凋亡率不斷升高，表明PA注射液對肺癌細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用。細胞凋亡的不同信號傳導通路構成復雜的網狀調控結構，細胞凋亡的線粒體途徑與死亡受體途徑可在Caspase-3或Bcl-2s基因產物處匯合，激活下游反應誘導凋亡發生。PA注射液可能通過凋亡途徑抑制肺癌細胞增殖，其機制可能為PA注射液的有效成分為菌毛上的甘露糖結合蛋白，能特異性地與高甘露糖表達型的腫瘤發生特異性結合，使腫瘤細胞微絨毛消失、電荷消失、去極化和流動性發生改變，腫瘤細胞增殖受限，改變其結構和功能，使增殖、侵襲、轉移能力降低，從而啟動凋亡程序，誘導細胞凋亡。

EGFR與腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成、侵襲及轉移有關，EGFR信號通路在肺癌的增殖中發揮重要作用。本研究結果顯示，加入EGFR抑制劑AG1478的AG1478組OD570高于PA組，細胞凋亡率低于PA組，提示PA注射液可能通過EGFR信號抑制肺癌細胞NCI-H1395和95-D的增殖、促進其凋亡。本研究為臨床上PA注射液輔助治療肺癌提供了理論依據。

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EffectsofPseudomonasaeruginosainjectiononproliferationandapoptosisoflungcancercells

YANJun1,ZHONGZhihong,SHIHuaqiu

(1FirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China)

ObjectiveTo explore the effects of pseudomonas aeruginosa (PA) injection on the cell proliferation and apoptosis of lung cancer cells, and to explore its mechanism.MethodsNCI-H1395 and 95-D of lung cancer cell lines were selected and then were inoculated in 96-well plate. We divided them into the control group and observation groups 1, 2, and 3, which were separately added with 0, 0.25×109, 0.5×109, and 1×109/mL PA injection for 24 h. In addition, the control group, PA group, and AG1478 group were set. The drug was not added into the control group, 1×109PA was added into the PA group, and 1×109/mL PA and 10-7mol/L EGFR inhibitor AG1478 were added into the AG1478 group. The proliferation of cells was observed by MTT. The apoptosis rate of each group was detected by the AnnexinV/PI double dye test.ResultsWith the increase of PA concentration, the OD570of NCI-H1395 and 95-D cells was decreasing, and the cell apoptosis rate increased (allP<0.05). Compared with the control group, the OD570of PA group decreased (P<0.05), while the apoptosis rate increased (P<0.05). Compared with the PA group, the OD570of AG1478 increased, and the apoptosis rate decreased (bothP<0.05).ConclusionPA injection can inhibit the proliferation of NCI-H1395 and 95-D of lung cancer cells and promote apoptosis through EGFR signaling pathway.

lung neoplasms; Pseudomonas aeruginosa injection; cell proliferation; apoptosis; epidermal growth factor receptor

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.004

R730.6

A

1002-266X(2017)45-0013-03

江西省衛生廳科技計劃課題(20143129)。

鄢俊(1979-)，男，主治醫師，主要研究方向為腫瘤學。E-mail: yanjun20170504@sina.com

施華球(1974-)，男，副主任醫師,主要研究方向為腫瘤學。E-mail: 249176821@qq.com

2017-05-04)