普羅布考聯合山莨菪堿對糖尿病大鼠對比劑腎損傷的影響

高巧營，劉晉津，吳騰，張一，李東華，趙凱

(天津市南開醫院，天津300100)

普羅布考聯合山莨菪堿對糖尿病大鼠對比劑腎損傷的影響

高巧營，劉晉津，吳騰，張一，李東華，趙凱

(天津市南開醫院，天津300100)

目的探討普羅布考聯合山莨菪堿對糖尿病大鼠對比劑腎病(CIN)的影響。方法選取130只大鼠制備糖尿病大鼠模型，將造模成功大鼠隨機分為模型組、普羅布考組、山莨菪堿組、聯合組各21只。另選10只正常大鼠為正常對照組。糖尿病造模9周后，普羅布考組及聯合組給予普羅布考500 mg/kg灌胃，連續6 d；第8天時，于制備CIN模型前，山莨菪堿組及聯合組經腹腔注射山莨菪堿100 μg/100 g，15 min后，模型組、普羅布考組、山莨菪堿組、聯合組經尾靜脈注射復方泛影葡胺注射液0.8 mL/100 g制備CIN模型；1 h后，山莨菪堿組、聯合組經腹腔注射山莨菪堿100 μg/100 g共7次。注射對比劑前及24 h后，采用CBB法測定尿蛋白。內眥靜脈取血，測定血清BUN、Scr水平。稱重，開腹后采集左右腎臟并稱重，計算腎指數。HE染色法觀察腎臟組織病理變化。取腎臟組織制成腎組織勻漿，測定氧化應激指標包括一氧化氮(NO)、一氧化氮合成酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T-AOC)。熒光定量PCR法檢測腎組織Bcl-2相關X蛋白質(Bax)和B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)mRNA表達。結果①模型組BUN、Scr、UAE均高于正常對照組(P均<0.05)。普羅布考組及聯合組BUN、Scr、UAE均低于模型組，聯合組BUN、Scr、UAE均低于山莨菪堿組(P均<0.05)。②模型組腎指數高于正常對照組，普羅布考組及聯合組腎指數低于模型組(P均<0.05)。③與模型組比較，普羅布考組、山莨菪堿組腎臟NOS水平升高，MDA水平降低(P均<0.05)。聯合組腎臟SOD、T-AOC均高于普羅布考組和山莨菪堿組(P均<0.05)。④與模型組比較，普羅布考組、聯合組腎臟Bax表達水平降低， Bcl-2及Bcl-2/Bax升高(P均<0.05)；山莨菪堿組腎臟Bcl-2/Bax升高(P<0.05)，聯合組腎臟Bcl-2/Bax高于山莨菪堿組(P<0.05)。結論普羅布考、山莨菪堿聯用可減輕糖尿病CIN大鼠的腎臟損傷，其機制可能與抑制氧化應激反應、上調Bcl-2/Bax比值有關，且效果優于單藥應用。

普羅布考；山莨菪堿；對比劑腎病；糖尿病；氧化應激；B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；Bcl-2相關X蛋白質

對比劑腎病(CIN)是指在排除其他原因的前提下，血管內應用對比劑72 h內發生的腎功能急性損害或腎功能損害加重[1]。糖尿病是發生CIN常見的危險因素之一[2]。當糖尿病患者伴有腎功能不全時CIN發病率明顯上升，可高達50%。普羅布考是一種較早應用于臨床的降脂藥物，具有抗氧化、抗炎、改善內皮細胞功能、抑制血管內膜增生等作用，目前已被應用于治療腎臟疾病[3]。山莨菪堿為M受體阻斷劑，具有抗休克、改善組織微循環灌注、抗自由基等作用，在腎臟疾病的治療中具有擴張腎小球小動脈、改善微循環、促進腎組織修復、有效清除氧自由基、減少腎臟細胞凋亡等作用[4]。可見上述兩種藥物均有抗氧化、保護腎組織損傷的作用。但目前，關于普羅布考、山莨菪堿聯合應用于CIN防治的研究較少。2015年3月～2016年5月，我們通過建立糖尿病大鼠CIN模型，觀察給予普羅布考、山莨菪堿聯合用藥后腎臟組織氧化應激反應相關因子及細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2表達的變化，探討兩藥聯合應用對糖尿病CIN大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 健康雄性SD大鼠140只，質量240～260 g，由軍事醫學科學院環境所動物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司；普羅布考購于承德頸復康藥業集團有限公司；山莨菪堿購于天津金耀藥業有限公司；復方泛影葡胺注射液購于湖南漢森制藥股份有限公司；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合成酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；動物組織RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；IQ5型熒光定量PCR儀購于美國Bio-rad公司；LEICA DM4000B正置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 模型制備及分組方法 140只大鼠中隨機挑取10只為正常對照組，其他130只大鼠禁食12 h稱重，經腹腔按60 mg/kg劑量注射STZ，注射72 h及1周后斷尾測血糖，以血糖>16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型構建成功。成模大鼠104只，隨機分為模型組、普羅布考組、山莨菪堿組、聯合組各21只。

1.3 干預方法 根據焦占全[5]和賈辛未[6]報道的CIN造模及用藥方法，結合臨床應用普羅布考預防CIN的方法及山莨菪堿半衰期短、起效快等藥代動力學特點，對聯合組采用先灌胃普羅布考6 d、再于CIN造模前后腹腔注射山莨菪堿的聯合用藥方法。糖尿病造模后飼養9周，普羅布考組及聯合組給予普羅布考500 mg/kg灌胃，正常對照組、模型組和山莨菪堿組給予等量生理鹽水灌胃，連續6 d；第7天時禁水不禁食。第8天時，于制備CIN模型前，山莨菪堿組及聯合組經腹腔注射山莨菪堿100 μg/100 g，正常對照組、模型組及普羅布考組腹腔注射等量生理鹽水；15 min后，模型組、普羅布考組、山莨菪堿組、聯合組經尾靜脈注射復方泛影葡胺注射液0.8 mL/100 g制備CIN模型；1 h后，山莨菪堿組、聯合組按1次/h經腹腔注射山莨菪堿100 μg/100 g共3次，之后再以1次/4 h腹腔注射4次。

1.4 腎功能相關指標檢測 注射對比劑前及24 h后，每組隨機選取8只大鼠放入代謝籠中，收集尿液，采用CBB法測定尿蛋白。各組剩余大鼠經內眥靜脈采血1 mL，離心留取上清液，采用脲酶法測定BUN，苦味酸法測定Scr。

1.5 腎指數測算 大鼠取血后，稱重。無菌條件下麻醉大鼠，開腹后采集左右腎臟并稱重，計算腎指數=腎質量/體質量。

1.6 腎臟組織病理觀察 將左腎剖開放入10%中性甲醛中固定，進行常規脫水，石蠟包埋，切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.7 腎組織勻漿氧化應激指標檢測 取剩余腎臟組織-80 ℃冰箱保存，制成腎組織勻漿，采用硝酸還原酶法測定NO，氧化還原法測定NOS，黃嘌呤氧化酶法測SOD，硫代巴比妥酸法測定MDA，比色法測定T-AOC。

1.8 腎組織Bax、Bcl-2 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。取腎臟組織，參照試劑盒操作說明提取腎組織總RNA，并進行逆轉錄。Bax、Bcl-2和GAPDH引物均由上海生工生物技術有限公司合成。引物序列：Bax上游5′-GCGAATTGGAGATGAACTGG-3′，下游5′-GTGAGCGAGGCGGTGAGGAC-3′；Bcl-2上游5′-CTGGTG-GACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-GGTCTGCTGACCTC-ACTTGTG-3′；GAPDH上游5′-AGATGGTGAAGGTCG-GTGTG-3′，下游5′-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3′。應用IQ5型熒光定量PCR儀進行定量檢測，每份樣本進行3個復孔測定，結果參照2-ΔΔCt法[7]進行分析。

2 結果

2.1 各組腎功能相關指標比較 模型組BUN、Scr、UAE均高于正常對照組(P均<0.05)。普羅布考組和聯合組BUN、Scr、UAE均低于模型組(P均<0.05)。聯合組BUN、Scr、UAE均低于山莨菪堿組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組腎指數比較 模型組腎指數高于正常對照組，普羅布考組及聯合組腎指數低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組腎功能相關指標及腎指數比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與普羅布考組比較，△P<0.05；與山莨菪堿組比較，▲P<0.05。

2.3 各組腎臟組織病理觀察 正常對照組腎小球、腎小管及間質未見病變，其余各組腎臟明顯增大、腎血管充血嚴重。模型組腎小體有的呈分葉狀；腎小管上皮細胞可見空泡樣變性、局部壞死；普羅布考組、山莨菪堿組和聯合組腎臟的病理變化基本同模型組，聯合組病理改變較模型組減輕。

2.4 各組腎組織勻漿氧化應激指標比較 與正常對照組比較，模型組腎臟NOS、MDA水平升高，而SOD及T-AOC水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，普羅布考組、山莨菪堿組腎臟NOS水平升高，MDA水平降低(P均<0.05)；聯合組腎臟NOS、SOD及T-AOC水平升高，MDA水平降低(P均<0.05)。聯合組腎臟SOD、T-AOC均高于普羅布考組和山莨菪堿組(P均<0.05)。

表2 各組腎組織勻漿氧化應激指標比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，﹟P<0.05；與普羅布考組比較，△P<0.05；與山莨菪堿組比較，▲P<0.05。

2.5 各組腎組織Bax、Bcl-2表達比較 與正常對照組比較，模型組腎臟Bax、Bcl-2表達及Bcl-2/Bax均降低(P均<0.05)。與模型組比較，普羅布考組、聯合組大鼠Bax表達降低，Bcl-2及Bcl-2/Bax升高(P均<0.05)；山莨菪堿組腎臟Bcl-2/Bax升高(P<0.05)。聯合組腎臟Bcl-2/Bax高于山莨菪堿組(P<0.05)。見表3。

表3 各組腎組織Bax、Bcl-2基因表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，﹟P<0.05；與普羅布考組比較，△P<0.05；與山莨菪堿組比較，▲P<0.05。

3 討論

隨著疾病診療方法的發展，對比劑越來越多地應用于臨床，如心腦血管的介入診療。對比劑是為增強影像觀察效果而注入(或服用)到人體組織或器官的化學制品，其可產生一定的不良反應如CIN，具體表現為使用對比劑后72 h內，血清肌酐水平升高44.2 μmol/L以上或比基礎值升高超過25%。臨床上大量使用對比劑導致的CIN已成為院內獲得性急性腎損傷的第三大原因[8]。CIN的發病機制尚不明確。研究發現，對比劑能直接損傷腎小管，誘導小管上皮細胞凋亡；可促進氧自由基、炎癥因子等產生，參與細胞凋亡。

糖尿病與心腦血管疾病關系密切，糖尿病患者發生心腦血管疾病的危險性明顯高于非糖尿病患者。心血管疾病已經成為2型糖尿病患者的主要死亡原因。臨床實踐發現，伴有糖尿病病史的心血管患者，進行介入診療時發生腎臟損害的危險性升高。流行病學研究顯示，糖尿病是CIN發生的最常見危險因素之一。Wasaki等[9]研究發現，高糖條件誘導的氧化應激反應增強了腎小球系膜細胞對對比劑細胞毒性的敏感性。還有學者提出對比劑與高血糖對細胞凋亡有協同作用。本研究發現，與正常對照組比較，模型組BUN、Scr、UAE、腎指數均增高，腎小體呈分葉狀，腎小管上皮細胞可見空泡樣變性、局部壞死，提示對比劑可導致糖尿病大鼠發生腎損傷，導致腎臟形態及功能異常。

細胞凋亡的誘導途徑可分為內源性途徑、外源性途徑和內質網途徑。內源性途徑始于線粒體，是最重要的凋亡途徑之一，Bcl-2家族在線粒體凋亡通路中起重要作用。Bcl-2和Bax是該家族中重要的凋亡基因。前者能阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，主要分布于線粒體膜、細胞膜內表面、內質網等處。后者主要促進細胞凋亡，細胞內Bcl-2與Bax的比值(Bcl-2/Bax)調節凋亡的發生。當該比值增加時，細胞趨于存活；比值下降時，細胞趨于凋亡。研究發現，CIN的發生與對比劑直接腎毒性促進細胞凋亡，誘導腎缺血及再灌注過程中產生的氧自由基損傷有重要關系[10]。本研究發現，模型組大鼠Bcl-2和Bax的mRNA表達均低于正常對照組，且Bcl-2/Bax比值降低，提示對比劑應用后可使糖尿病大鼠腎臟凋亡細胞增加。

Bcl-2 除通過直接調節線粒體膜通透性外，還可通過影響ROS產生來阻礙細胞凋亡。有學者認為CIN發生機制中氧自由基損傷作用亦處于主導地位[11]。本研究發現，與正常對照組比較，除NO外，模型組大鼠腎臟NOS活力和MDA水平升高，而SOD和T-AOC降低，提示對比劑應用后可使糖尿病大鼠腎臟產生過多的氧自由基，減少了保護細胞免受損傷的因子，可能與對比劑導致腎損傷的機制有關。

目前，水化治療已明確對CIN有治療作用，但臨床上被證實對CIN有確切效果的藥物并不多。臨床上普羅布考多作為降脂藥出現，研究者經過長期觀察發現它具有保護腎功能，可降低CIN發生率。趙凱等[12]發現，對接受PCI治療的不穩定型心絞痛老年患者預防性應用普羅布考可有效減少CIN的發生。山莨菪堿已被廣泛用于治療急性腎小球腎炎和糖尿病腎病，對腎功能具有良好保護作用。汪雁博等[13]臨床研究發現，山莨菪堿不僅可減輕介入治療的患者腎功能損傷程度，還有助于患者腎功能的恢復。但目前其尚未被廣泛地應用于預防CIN。學者發現普羅布考和山莨菪堿均具有抗氧化作用[14,15]。本研究發現，普羅布考組和聯合組大鼠腎指數、BUN、Scr、UAE均低于模型組，且聯合組上述腎功能指標亦低于山莨菪堿組，提示普羅布考及兩藥聯合使用可改善CIN大鼠的腎功能；與模型組比較，聯合組大鼠腎臟NOS、SOD及T-AOC水平升高，MDA水平降低，且SOD和T-AOC均高于普羅布考組和山莨菪堿組，提示兩藥均可減少氧自由基的產生，且兩藥聯合使用還可增加腎臟抗氧化因子的產生，故兩藥單獨或聯合使用均可減輕氧化應激反應，保護CIN大鼠腎組織免受損傷，兩藥具有協同作用；與模型組比較，普羅布考組和聯合組大鼠Bax表達水平降低，Bcl-2及Bcl-2/Bax升高；山莨菪堿組大鼠Bcl-2/Bax亦升高，聯合組大鼠腎臟Bcl-2/Bax高于山莨菪堿組，提示普羅布考與山莨菪堿均可減少腎臟細胞凋亡數，減輕腎功能損害，而兩藥聯合應用作用更強。

綜上，普羅布考、山莨菪堿聯用可減輕糖尿病CIN大鼠的腎臟損傷，其機制可能與抑制氧化應激反應、上調Bcl-2/Bax，從而減少腎細胞凋亡有關，且效果優于單藥應用。

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Effectofprobucolcombinedwithanisodamineoncontrast-inducednephropathyindiabeticrats

GAOQiaoying,LIUJinjin,WUTeng,ZHANGYi,LIDonghua,ZHAOKai

(TianjinNankaiHospital,Tianjin300100,China)

ObjectiveTo explore the synergistic effect of probucol combined with anisodamine on contrast-induced nephropathy (CIN) in diabetic rats.MethodsTotally 130 rats were selected to make the models of diabetic rats. The diabetic rat models were randomly divided into the model group, probucol group, anisodamine group, and the combination group (probucol combined with anisodamine), with 21 rats in each group. In addition, 10 normal rats were selected as the control group. After 9-week feeding, the diabetic rats in the probucol group and the combination group

intragastric administration of probucol (500 mg/kg) for 6 d. On the eighth day, rats in the anisodamine group and combination group were injected with anisodamine 100 μg/100g intraperitoneally before the preparation of CIN model. After 15 min, all diabetic rats were injected with urografin 0.8 mL/100 g intravenously to prepare the CIN models. One hour later, rats in the anisodamine group and combination group were given anisodamine 100 μg/100 g intraperitoneally for 7 times. The coomassie brilliant blue (CBB) was used to determine the urinary protein before and after injection with contrast medium 24 h. Blood samples were taken from the inner canthus vein for measuring the serum BUN and Scr levels. After weighed, the left and right kidneys of all rats were also weighed for calculating the renal index. Pathological changes of kidneys were observed by HE staining. The renal tissues were homogenized for testing nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and total antioxidant capacity (T-AOC). The expression levels of B cell lymphoma/leukemia-2 gene (Bcl-2) and Bcl-2-related X protein (Bax) mRNA were detected by fluorescent quantitative PCR.Results①The levels of BUN, Scr, and UAE in the model group were higher than those in the control group. The levels of BUN, Scr and UAE in the probucol group and combination group were lower than those in the model group, and the levels of BUN, Scr, and UAE in the combination group were lower than those of the anisodamine group (allP<0.05). ②The renal index in the model group was higher than that of the control group, and the renal index in the probucol group and the combination group was lower than that in the model group (allP<0.05). ③Compared with the model group, the NOS level increased and MDA decreased in the probucol group and anisodamine group (bothP<0.05). The levels of SOD and T-AOC in the combination group were higher than those in the probucol group and anisodamine group (bothP<0.05). ④Compared with the model group, the Bax expression decreased, the levels of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax increased in the probucol group and combination group (allP<0.05), and the ratio of Bcl-2/Bax in the anisodamine group increased (P<0.05). The ratio of Bcl-2/Bax in the combination group was higher than that in the anisodamine group (P<0.05).ConclusionThe probucol combined with anisodamine can alleviate the renal injury of diabetic CIN rats. The mechanism may be related to the inhibition of oxidative stress and up-regulation of Bcl-2/Bax ratio, and the effect is superior to single drug application.

probucol; anisodamine; contrast-induced nephropathy; diabetes mellitus; oxidative stress; B cell lymphoma/leukemia-2 gene; Bcl-2 related X protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.002

R692.9；R818.03

A

1002-266X(2017)46-0007-05

天津市衛生局科技基金項目(2014KZ050)。

高巧營(1982-)，女，碩士，研究方向為藥理學。 E-mail: 843262515@qq.com

趙凱(1980-)，男，碩士，副主任醫師，研究方向為心血管內科學。E-mail: zhaokai155@sohu.com

2017-05-22)

·作者·編者·讀者·

《山東醫藥》參考文獻著錄要求

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