ⅢA-N2期非小細胞肺癌組織TYMS基因mRNA表達與EGFR基因突變的相關性研究

李 喆，楊 揚，劉延風，許瑞彬，戎鐵華，張蘭軍△

(1.延安大學附屬醫院胸外科，陜西延安 716000；2.中山大學腫瘤防治中心胸科/華南腫瘤學國家重點實驗室，廣州 510060)

論著·臨床研究

ⅢA-N2期非小細胞肺癌組織TYMS基因mRNA表達與EGFR基因突變的相關性研究

李 喆1，楊 揚1，劉延風1，許瑞彬1，戎鐵華2，張蘭軍2△

(1.延安大學附屬醫院胸外科，陜西延安 716000；2.中山大學腫瘤防治中心胸科/華南腫瘤學國家重點實驗室，廣州 510060)

目的探討ⅢA-N2期非小細胞肺癌(NSCLC)組織胸苷酸合成酶(TYMS)基因mRNA表達與表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的相關性。方法分別用分支DNA-液相芯片法及突變富集-液相芯片法檢測30例病理分期為ⅢA-N2期的NSCLC組織TYMS mRNA表達及EGFR基因19號及21號外顯子突變狀況，并對檢測結果進行整理分析。結果30例患者中，TYMS mRNA低表達14例(46.7%)，中偏低表達7例(23.3%)，中表達7例(23.3%)，中偏高表達0例，高表達2例(6.7%)；12例檢出EGFR基因突變，突變率為40.0%，其中6例為19外顯子缺失突變，6例為21外顯子置換突變。TYMS mRNA表達水平與EGFR突變相關，EGFR突變多發生在TYMS mRNA較低表達水平的患者腫瘤組織中(Z=-2.604,P=0.009)。結論NSCLC組織中TYMS mRNA表達與EGFR基因突變相關，可為今后臨床中針對不同條件的患者相關藥物的選用提供參考。

癌，非小細胞肺；胸苷酸合成酶；受體，表皮生長因子；基因表達；基因突變

肺癌目前已成為惡性腫瘤相關死亡的首要原因，其中非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)約占總發病率的80%[1-3]。即使采取積極的治療，NSCLC患者的5年生存率仍然很低。隨著全球范圍內腫瘤學研究者的不斷努力，目前對NSCLC的治療逐漸從傳統治療向個體化、精準醫療轉變，在基因層面找出藥物作用靶點，提高藥物療效。胸苷酸合成酶(TYMS)是催化體內胸苷酸合成所必需的酶，是腫瘤生長的重要因子，為葉酸類似物氨甲蝶呤和培美曲塞的治療靶點。培美曲塞目前已成為NSCLC中非鱗癌患者的一線用藥，其療效與TYMS基因mRNA表達水平呈負相關[4-6]。以表皮生長因子受體(EGFR)基因突變為靶點的絡氨酸激酶受體抑制劑(TKIs)目前也被納入一線治療方案以治療存在EGFR基因突變的NSCLC患者。培美曲塞和EGFR-TKIs均以NSCLC患者為治療對象，雖然前者不推薦鱗癌患者使用，但二者在患者選擇上存在很大的交集。本研究旨在分析培美曲塞與EGFR-TKIs所針對的基因靶點是否存在一定的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集中山大學腫瘤防治中心及延安大學附屬醫院2015年6月至2016年6月收治的手術切除并經病理證實且分期為ⅢA-N2期的30例患者NSCLC組織標本及完整的病例資料。所有患者均行肺癌根治術(原發瘤體肺葉完整切除+縱隔淋巴結清掃)，術前均未行任何抗腫瘤治療(包括化療、靶向治療及放療)。30例患者中男18例，女12例；年齡44～69歲，平均(55.87±1.39)歲；16例(53.3%)患者有吸煙史，

圖1 TYMS mRNA表達區分圖

14例(46.7%)患者無吸煙史；按照世界衛生組織的標準進行病理分型：鱗癌8例(26.7%)，腺癌17例(56.7%)，其他病理類型5例(16.7%)；病理分期：高度分化(G1期)2例(6.7%)，中度分化(G2期)7例(23.3%)，低分化(G3期)17例(56.7%)，未分化(G4期)4例(13.3%)。

1.2方法 分別用分支DNA-液相芯片法及突變富集-液相芯片法檢測NSCLC組織TYMS mRNA表達及EGFR基因19號及21號外顯子突變狀況，由廣州益善生物技術有限公司完成。

1.2.1TYMS mRNA表達的檢測 甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織標本按照以下步驟處理。將樣品于均質溶液中65 ℃處理2 h，反應后的混合物離心，去除殘留的石蠟和碎片，將上清液轉移到新的離心管，96孔板每孔加入40 μL樣品混合液，再加入18.5 μL無RNA酶的去離子水、33.3 μL裂解液、2 μL阻斷劑、1 μL磁珠和5 μL特異結合目標基因的探針。將96孔板密封后54 ℃ 750 r/min搖床孵育18 h，再用96孔過濾板過濾混合物。真空狀態下，用250 μL洗滌緩沖液(0.1×SSC和0.03%鋰十二烷基硫酸鈉)洗滌3次，去除未結合的RNA和其他雜質，再通過相關步驟檢測結合的目標mRNA。用Luminex 200系統分析樣品的熒光值，代入建立的特定人群檢測數據庫轉換為百分比，特定人群數據庫中mRNA表達水平在人群中25%、75%的位置為兩條主要分界線，以此區分低和中、中和高表達，其中中表達又以40%、60%細分為中偏低、中及中偏高表達，最后分為低表達、中偏低表達、中表達、中偏高表達和高表達。

1.2.2EGFR基因突變的檢測 首先用DNA提取試劑盒提取組織標本DNA，通過多重PCR獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段；再將PCR產物經核酸外切酶酶切及堿性磷酸酶水解，去除多余的引物和dNTP；產物再以等位基因特異性引物延伸(ASPE)特異地識別各等位基因，并形成延伸產物；ASPE引物上的Tag序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結合(雜交反應)，37 ℃雜交30 min后加入25 μL 鏈霉素親和素-藻紅蛋白(SA-PE)工作液，繼續37 ℃反應10 min，用Luminex 200系統分析樣品的熒光值。

1.3統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，二分類變量資料的分析采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；有序多分類資料比較采用Kruskal WallisH檢驗；采用Mann-WhitneyU檢驗對有序多分類資料與二分類變量間的關系進行分析。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1TYMS mRNA表達與EGFR基因突變情況 TYMS mRNA表達區分圖見圖1，圖中每個圓圈代表一個數據點。30例患者NSCLC組織TYMS mRNA低表達者14例(46.7%)，中偏低表達者7例(23.3%)，中表達者7例(23.3%)，中偏高表達者0例，高表達者2例(6.7%)。30例患者NSCLC組織EGFR突變率為40.0%(12/30)，其中6例(20.0%)為19外顯子缺失突變，6例(20.0%)為21外顯子置換突變。

2.2TYMS mRNA表達、EGFR基因突變與患者臨床病理特征的關系 30例患者NSCLC組織標本TYMS mRNA表達及EGFR基因突變與各臨床病理特征無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

表1 TYMS mRNA表達、EGFR基因突變與患者臨床病理特征的關系

2.3TYMS mRNA表達與EGFR基因突變的相關性 12例EGFR基因突變者TYMS mRNA表達水平中位數及范圍為1(1～3)，18例野生型EGFR基因患者TYMS mRNA表達水平中位數及范圍為2(1～5)，TYMS mRNA表達水平與EGFR基因突變明顯相關，EGFR突變多發生在TYMS mRNA較低表達水平者腫瘤組織中(Z=-2.604，P=0.009)。

3 討 論

基于患者的臨床、病理特征選擇NSCLC化療方案只有少數患者獲益，其有效率僅20%～40%，平均生存時間為8～10個月，5年生存率低于15%，此外部分患者有嚴重的不良反應。因此，個體化、精準醫療逐漸被廣大學者提倡，從基因層面尋求更多藥物作用靶點，選擇精確、不良反應小的藥物，使更多的患者受益，增加患者生存率。

目前NSCLC患者以腺癌最為常見，而EGFR基因突變通常發生在亞裔、女性、不吸煙及腺癌患者中[1，7]，這些患者往往能從EGFR-TKIs治療中獲益。培美曲塞目前作為非鱗癌患者化療的一線用藥，主要針對腺癌患者，部分研究發現其靶點基因TYMS mRNA在男性、吸煙及非腺癌患者中高表達[8-10]。培美曲塞與EGFR-TKIs針對的患者存在很大的交集，其作用的靶點基因是否存在一定的相關性尚不明確。本研究結果顯示，培美曲塞所作用的靶點基因TYMS mRNA表達水平與EGFR基因突變存在明顯的相關性，EGFR基因突變多發生在TYMS mRNA較低表達水平的患者腫瘤組織中(P=0.009)。

著名的國際Ⅲ期注冊臨床研究LUX-Lung 3比較了EGFR-TKIs藥物阿法替尼與化療藥物培美曲塞聯合順鉑治療伴EGFR突變的Ⅲb期或Ⅳ期肺腺癌患者的療效，主要終點為無進展生存期(PFS)，結果顯示：阿法替尼組患者較培美曲塞聯合順鉑組的PFS顯著延長(11.1個月vs. 6.9個月，HR=0.58，P=0.000 4)。值得重視的是，在伴有EGFR突變型(19位點缺失和L858R突變占所有EGFR突變的90%)的患者中，接受阿法替尼治療后中位PFS超過1年(13.6個月)，而對照組僅 6.9個月(P<0.01)[11]。雖然該項臨床研究顯示EGFR基因突變的肺腺癌患者用阿法替尼較化療延長了中位PFS，但后續的試驗及薈萃分析顯示與化療藥物比較，一線應用EGFR-TKIs藥物并不能延長EGFR基因突變的NSCLC患者的總生存期[12]。上述臨床試驗僅篩選了EGFR基因突變陽性的患者，并未檢測及篩選針對鉑類藥物的ERCC1 mRNA及針對培美曲塞的TYMS mRNA表達。肺癌化療療效受許多耐藥機制的影響，為多基因、多步驟綜合作用的結果。臨床數據及本研究結果顯示，TYMS基因mRNA低表達及EGFR基因突變在NSCLC患者中存在很大的交集，所以在今后的臨床試驗及臨床用藥中是否應該予以考慮值得思考。

本研究TYMS mRNA表達及EGFR基因突變與臨床病理特征之間未發現明顯相關性，可能與樣本量較小有關。但研究發現TYMS mRNA表達水平與EGFR基因突變存在明顯的相關性，EGFR基因突變多發生在TYMS mRNA較低表達水平的患者腫瘤組織中。這種腫瘤多基因間的相關性，提示今后在臨床試驗設計、臨床藥物選擇中應該全方面考慮，探討出更合理的方案，達到個體化、精確化用藥。

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StudyoncorrelationbetweenTYMSgenemRNAexpressionandEGFRgenemutationinstageⅢA-N2non-small-celllungcancertissue

LiZhe1，YangYang1，LiuYanfeng1，XuRuibin1，RongTiehua2，ZhangLanjun2△

(1.DepartmentofThoracicSurgery,AffiliatedHospital,Yan′anUniversity,Yan′an,Shaanxi716000,China2.DepartmentofThoracicSurgery/StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,CenterofTumorPreventionandTreatment,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,Guangdong510060,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between TYMS gene mRNA expression level and EGFR mutation in stage ⅢA-N2 non-small-cell lung cancer tissue (NSCLC).MethodsThe branched DNA-liquidchip technology (bDNA-LCT) and mutant-enriched liquidchip (MEL) technology were used to detect the TYMS mRNA expression and EGFR mutations at exon 19 and 21 in NSCLC tissues from 30 patients with stages ⅢA-N2 NSCLC,and the results were analyzed.ResultsAmong 30 cases,low TYMS mRNA expression was in 14 cases (46.7%),middle to low TYMS mRNA expression in 7 cases (23.3%),middle mRNA expression in 7 cases (23.3%),middle to high TYMS mRNA expression in 0 case and high TYMS mRNA expression in 2 cases (6.7%);12 cases of EGFR mutation were detected out with the mutation rate of 40.0%,including 6 cases of exon 19 deletion and 6 cases of exon 21 missense mutation.The TYMS mRNA expression level was correlated with the EGFR mutation.The EGFR mutation commonly occurred in the tumor tissue of the patients with TYMS mRNA low expression (Z=-2.604,P=0.009).ConclusionThe TYMS mRNA expression in NSCLC tissue is correlated with the EGFR gene mutation,which can provide references for the drug selection aiming at the patients with different conditions.

carcinoma，non-small-cell lung；thymidylate synthetase；receptor，epidermal growth factor；gene expression；gene mutation

李喆(1983-)，主治醫師，碩士，主要從事胸部腫瘤基礎及臨床研究。△

，E-mail:zhlanj@mail.sysu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.025

R734.2

A

1671-8348(2017)35-4977-03

2017-07-23

2017-09-30)