經后增殖方含藥血清對超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9與Bim表達的影響*

楊 貞，郭新宇，劉佳子，鄧偉民，張金玉

(1.廣州軍區廣州總醫院生殖醫學中心，廣州 510010；2.廣州中醫藥大學研究生院，廣州 510405；3.汕頭大學醫學院附屬第一醫院康復科，廣東汕頭 515041)

論著·基礎研究

經后增殖方含藥血清對超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9與Bim表達的影響*

楊 貞1，2，郭新宇1△，劉佳子3，鄧偉民1，張金玉1

(1.廣州軍區廣州總醫院生殖醫學中心，廣州 510010；2.廣州中醫藥大學研究生院，廣州 510405；3.汕頭大學醫學院附屬第一醫院康復科，廣東汕頭 515041)

目的觀察經后增殖方含藥血清對超排卵大鼠卵巢的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)及卵丘細胞(CCs)中生長分化因子9(GDF9)及Bim表達的影響，探討其治療效果及作用機制。方法制備大鼠超排卵卵巢模型，收集COCs和CCs，分別與雌性SD超排卵大鼠空白血清和經后增殖方藥物血清在體外共同培養，各分3組：空白血清組(空白組)、含藥血清組(對照組)、含藥血清+GDF9受體阻斷劑組(實驗組)，共6組。24 h后收集COCs和CCs，實時熒光定量PCR檢測GDF9和Bim mRNA表達水平，蛋白質印跡法檢測GDF9蛋白表達水平。結果(1)對照組COCs中GDF9 mRNA表達水平明顯高于空白組和實驗組(P<0.05)；對照組和實驗組COCs中Bim mRNA表達水平均明顯低于空白組(P<0.05)；對照組COCs中GDF9蛋白表達水平明顯高于空白組(P<0.05)，亦高于實驗組，但差異無統計學意義(P>0.05)。(2)CCs中GDF9 mRNA表達水平在3組間的差異性比較結果與COCs中一致；對照組和實驗組CCs中Bim mRNA表達水平均明顯低于空白組(P<0.05)；對照組CCs中Bim mRNA表達水平明顯低于實驗組(P<0.05)；對照組CCs中GDF9蛋白表達水平明顯高于空白組和實驗組(P<0.05)。(3)對照組COCs中GDF9 mRNA表達水平明顯高于CCs中(P<0.05)，其余組內COSs和CCs比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論經后增殖方含藥血清能提高COCs和CCs中GDF9的表達水平，維持COCs和CCs中Bim的低水平表達，抑制細胞凋亡，促進卵泡發育；COCs較剔除卵母細胞的CCs更有利于GDF9 mRNA的表達。

經后增殖方；超排卵；卵丘-卵母細胞復合體；卵丘細胞；生長分化因子9；Bim

控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)周期中的重要環節，常用方案為先使用促性腺激素釋放激素激動劑進行垂體降調節，然后用促性腺激素刺激卵巢，使多個卵泡同時發育，從而同時獲取多個卵子進行體外受精，有別于自然周期的單卵排卵。已有研究證實超排卵可能損傷卵細胞染色體的結構和功能，影響胚胎的基因表達，從而降低胚胎的著床潛能[1]，導致胚胎著床率和妊娠率顯著下降[2]。中醫藥介入IVF-ET周期收效顯著，本課題組前期研究證實益氣血補肝腎中藥能提高胚胎移植成功率和妊娠率[3]。本研究提取COH大鼠卵巢中卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)和卵丘細胞(cumulus cells，CCs)，加入經后增殖方含藥血清進行體外培養，檢測COCs和CCs中生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)和Bim的表達水平，探討益氣血中藥對提高IVF-ET周期卵泡質量的效果及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD雌性大鼠42只，鼠齡6～8周，體質量180～220 g，由廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心提供(合格證號：44007200031374，44002100009700)。適應性飼養1周后進入實驗階段，自然光照，自由取水和攝食，以陰道脫落細胞涂片檢查動情周期。

1.1.2實驗藥品 醋酸曲普瑞林(GnRHa，瑞士輝凌公司，商品：名達必佳，批號：K18565B)；孕馬血清促性腺激素(PMSG，美國Sigma公司，批號：SLBP4544V)；人絨毛膜促性腺激素(HCG，麗珠藥業有限公司，批號：160201)；經后增殖方(顆粒劑，每袋10 g，廣東一方制藥有限公司，批號：Q1511004)，每袋相當于生藥：黨參15 g,白術12 g,茯苓12 g,甘草6 g,熟地黃12 g,白芍12 g,當歸6 g,川芎6 g,菟絲子15 g,鹿角霜20 g,杜仲15 g,山萸肉10 g,川椒3 g。

1.1.3主要儀器與試劑 反轉錄試劑盒(德國DBI公司，批號：DBI-2220)，熒光定量PCR檢測試劑盒(美國Genecopoeia公司，批號：AOPR-1200)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(杭州弗德生物，批號：FD2001)，山羊抗大鼠GDF-9抗體(美國Santa公司，批號：sc-12244)，小鼠抗大鼠β-actin抗體(北京博奧森，批號：Bsm-33036M)，熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號：7500)。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備及滅活 12只雌性大鼠連續觀察2個動情周期均正常，隨機分為含藥血清組和空白血清組，每組6只。陰道涂片為動情后期(動情周期第3天)，兩組大鼠均于每日上午9時腹腔注射GnRHa 2.0 μg/100 g，連續7 d，第7天同時注射PMSG 40 IU/100 g，48 h后注射HCG 100 IU/100 g。從第1天注射GnRHa開始，同時含藥血清組大鼠每日上午9時給予經后增殖方4.5 g/kg(相當于3倍臨床等效劑量)，空白血清組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，至注射HCG日，共9 d。第9天灌胃及注射HCG后1.5 h，腹腔注射10%水合氯醛4.0 mL/kg，深入麻醉大鼠后腹主動脈取血。將各組血液置于4 ℃放置2 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液，56 ℃ 30 min滅活，用0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，同組血清混勻分裝，-20 ℃保存備用。

1.2.2COCs和CCs的制備 30只雌性大鼠連續觀察2個動情周期均正常。陰道涂片為動情后期(動情周期第3天)，于每日上午9時腹腔注射GnRHa 2.0 μg/100 g，連續7 d，第7天同時注射PMSG 40 IU/100 g，48 h后注射HCG 100 IU/100 g，2 h后頸椎脫臼處死，無菌條件下快速取出小鼠雙側卵巢，37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)過夜預熱的M199培養液中洗3次，37 ℃恒溫板上，立體顯微鏡下，10 mL注射器吸取大卵泡中的COCs，選取形態良好的COCs。(1)取一半COCs置于M199培養液(美國Hyclone公司)中，37 ℃ 5% CO2孵箱暫存備用。(2)另一半COCs置于0.1%透明質酸酶(美國Sigma公司)中，用一次性注射針頭刺破卵泡，使CCs釋放入培養液中，并輕輕吹打，使其分散成單個細胞，加入M199培養液終止消化，200目一次性細胞篩過濾。將含CCs的培養液收集在離心管中，以1 000 r/min離心5 min收集細胞，培養液洗2次后，加一定量的培養液重懸細胞，臺盼藍染色，血細胞計數板計數活細胞數，細胞存活數大于85%，M199培養液將CCs懸液調整為1×106cells/mL的單細胞懸液備用。

1.2.3COCs和CCs的培養 將COCs和CCs分別隨機種入已用0.05% L-多聚賴氨酸涂布的6孔培養板中，COCs和CCs各隨機分為3組，每組3個復孔，加入大鼠血清及青鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)，形成含10%大鼠血清[各組分別加入空白血清(空白組)，含藥血清(對照組)，含藥血清+GDF9受體阻斷劑(實驗組，GDF9受體阻斷劑為美國R&D公司產品)]、1%雙抗的M199培養液。培養24 h后，收集各組細胞待測。

1.2.4實時熒光定量PCR法檢測GDF9 mRNA和Bim mRNA的表達 實時熒光定量PCR操作按試劑盒說明書進行。GDF9上游引物序列：5′-GCA GAT TCC TGT TGG GGG TT-3′，下游引物序列：5′-TAC AGG CAA CAG CAA GGA CC-3′，擴增長度100 bp；Bim上游引物序列：5′-AGA GAT ACG GAT CGC ACA GG-3′，下游引物序列：5′-GTC TTC CGC CTC TCG GTA AT-3′，擴增長度100 bp；內參β-actin上游引物序列：5′-AGT TCA ACG GCA CAG TCA AG-3′，下游引物序列：5′-TAC TCA GCA CCA GCA TCA CC-3′，擴增長度118 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃ 10 min預變性；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，退火、變性、延伸，40個循環。根據各組樣品的Ct值(Ct值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數)，以β-actin進行參照，折算出各樣品起始模板數的相對數量關系。計算公式：目的基因的相對量以2-ΔΔCt值表示，ΔΔCt=[Ct(待測樣品目的基因)-Ct(待測樣品內參基因)]-[Ct(對照組樣品目的基因)-Ct(對照組樣品內參基因)]。

1.2.5蛋白質印跡法(Western blot)檢測GDF9蛋白的表達 提取大鼠COCs和CCs總蛋白液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白水平后，各組樣品分別取60 μg蛋白，加適量5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣，濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V，電泳至溴酚藍剛跑出即終止電泳，將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將轉好的膜于室溫下脫色搖床上用5%脫脂奶粉(含0.5% TBST)封閉1 h。加入用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋的一抗(山羊抗大鼠GDF-9抗體1∶500，小鼠抗大鼠β-actin抗體1∶2 000)，4 ℃過夜；用TBST在室溫下洗3次，每次5 min；加入用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋的二抗[辣根過氧化物酶(HRP)-兔抗山羊IgG抗體1∶1 000，HRP-山羊抗小鼠IgG抗體1∶5 000)，室溫下孵育30 min后，用TBST室溫下洗3次，每次5 min。采用電化學發光(ECL)法顯影曝光。X線片曝光顯影。采用Image J軟件處理系統分析目標帶的吸光度值(A值)。以GDF9/β-actin的相對A值表示結果。

A：Bim mRNA；B：GDF9 mRNA；C：GDF9蛋白；①：空白組；②：對照組；③：實驗組

圖1 COCs和CCs中Bim mRNA、GDF9 mRNA和GDF9蛋白相對表達水平表1 COCs和CCs中Bim mRNA、GDF9 mRNA及GDF9蛋白相對表達水平比較

*：P<0.05，與空白組COCs比較；#：P<0.05，與空白組CCs比較；△:P<0.05，與實驗組COCs組比較；▽：P<0.05，與實驗組CCs比較；▲：P<0.05，與同組COCs比較

2 結 果

2.1COCs和CCs中Bim mRNA相對表達水平 熔解曲線均呈單峰分布，無基因組DNA的非特異擴增。(1)COCs中：對照組和實驗組Bim mRNA相對表達水平均明顯低于空白組(P<0.05)，對照組Bim mRNA相對表達水平低于實驗組，但差異無統計學意義(P>0.05)；(2)CCs中：對照組和實驗組Bim mRNA相對表達水平均明顯低于空白組(P<0.05)，對照組Bim mRNA相對表達水平明顯低于實驗組(P<0.05)；(3)各組COCs中Bim mRNA相對表達水平均低于相對應各組CCs中Bim mRNA相對表達水平，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1A、表1。

2.2COCs和CCs中GDF9 mRNA相對表達水平 熔解曲線均呈單峰分布，無基因組DNA的非特異擴增。(1)COCs中：對照組GDF9 mRNA相對表達水平明顯高于空白組和實驗組(P<0.05)；(2)CCs中：對照組GDF9 mRNA相對表達水平明顯高于空白組和實驗組(P<0.05)；(3)各組COCs中GDF9 mRNA相對表達水平均高于相對應各組CCs中，其中對照組COCs和CCs中GDF9 mRNA相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，空白組、實驗組差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1B、表1。

2.3COCs和CCs中GDF9蛋白相對表達水平比較 (1)COCs中：對照組GDF9蛋白相對表達水平明顯高于空白組(P<0.05)，亦高于實驗組，但差異無統計學意義(P>0.05)；(2)CCs中：對照組GDF9蛋白相對表達水平明顯高于空白組和實驗組(P<0.05)；(3)各組COCs中GDF9蛋白相對表達水平與相對應各組CCs中比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1C、圖2、表1。

①：空白組CCs；②：對照組CCs；③：實驗組CCs；④：空白組COCs；⑤：對照組COCs；⑥：實驗組COCs

圖2 COCs和CCs中GDF9蛋白表達電泳圖

3 討 論

COCs是哺乳動物卵巢的基本功能單位，包括一個卵母細胞和圍繞其周圍的CCs。CCs與卵母細胞關系密切，CCs直接影響卵母細胞的發育、成熟，進而影響胚胎的質量，而卵母細胞也可以通過分泌卵細胞分泌因子(oocyte secreted factors，OSFs)來調節CCs的生長分化，在卵母細胞的成熟過程中，二者相互影響，缺一不可[4]。近年來通過卵母細胞與顆粒細胞重建卵泡的研究提示，卵母細胞在調控卵泡發育中起主導作用，OSFs通過旁分泌作用促進卵泡的形成，卵丘擴張及某些代謝過程，同時OSFs被證實具有維持CCs低凋亡率的作用，而CCs保持良好生物學活性是卵細胞質量的保證[5-6]。

作為其中一種OSFs，GDF9是轉化生長因子β超家族成員，其表達可見于早期初級卵泡階段，對顆粒細胞的增殖、分化、排卵及黃素化起調控作用，與卵泡的生長和發育關系密切，是卵泡發育的重要因子，并可能與胚胎發育有關，卵泡液中的GDF9水平高低可以預測卵母細胞及胚胎質量[7-10]。因此，最近的一些研究已經把GDF9列為評價卵母細胞質量及其發育潛能的重要指標[11-12]。顆粒細胞的凋亡促進卵泡閉鎖，使卵泡無法回到正常的發育軌道[13]。目前已經闡明有兩條凋亡信號傳導途徑：(1)外源性死亡受體途徑，由Fas/TNF2A通路激發；(2)內源性線粒體途徑，由Bcl-2基因家族激發[14]。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，在機體多種組織包括生殖細胞中有不同程度的表達[15]，在凋亡的啟動和調節上具有重要的作用。不同的Bim異構體可通過直接激活Bax蛋白，或通過抑制Bcl-2的抗凋亡活性間接激活Bax/Bak引起線粒體途徑的細胞凋亡。因此其表達上調可促進細胞凋亡，是一種重要的凋亡調節蛋白[16]。因此，本研究選取GDF9和Bim作為檢測指標，觀察具有益氣血作用的經后增殖方對卵泡發育的作用機制。

中醫學的“腎氣-天癸-沖任”生殖軸與西醫學的“下丘腦-垂體-卵巢”性腺軸相對應。中醫認為，受孕的機理在于腎氣充，天癸至，沖任調和，精血津液充沛。不孕主要與腎氣不足，沖任氣血虧虛有關。因此在治療上通常以補腎、益氣、養血為主。本研究所用經后增殖方由《太平惠民和劑局方》之八珍湯加減演化而來，方中四君子湯(黨參、白術、茯苓、甘草)健脾益氣；四物湯(熟地黃、當歸、白芍、川芎)補血活血；另加補腎精血之山萸肉，陰陽并補之菟絲子，兩藥同用有養精種子之效；鹿角霜、杜仲、川椒溫陽暖宮。全方使氣血雙補，氣生血長，又得腎陽溫煦，胎孕易成。筆者早前的臨床觀察表明該方在卵泡期可能通過增強“下丘腦-垂體-卵巢”性腺軸的調理功能，改善卵母細胞質量，促進卵泡發育，增強胚胎著床潛能，提高胚胎的種植率[3]。

本研究結果顯示，對照組COCs和CCs中GDF9 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于空白組(P<0.05)，說明經后增殖方含藥血清能顯著提高GDF9 mRNA和蛋白的表達水平，從而對抗細胞凋亡，促進卵泡發育；加入GDF9受體阻斷劑能阻斷含藥血清對GDF9表達的影響(P<0.05)。而對照組COCs中GDF9 mRNA表達水平明顯高于CCs中(P<0.05)，說明經后增殖方含藥血清有助于卵母細胞和CCs之間的相互影響，促進卵母細胞分泌GDF9 mRNA，二者相互依存，相互促進。剔除了卵母細胞，GDF9 mRNA的表達顯著下降，CCs的功能將受到明顯影響。經后增殖方含藥血清能明顯抑制COCs和CCs中Bim基因的表達(P<0.05)，而在加入含藥血清的同時加入了GDF9受體阻斷劑，COCs和CCs中Bim基因的表達水平仍然受到明顯抑制(P<0.05)，說明GDF9受體阻斷劑能特異性阻斷GDF9受體的作用，但對Bim并無直接影響，因此經后增殖方含藥血清仍能發揮對Bim表達的抑制作用。然而該水平仍高于未加入GDF9受體阻斷劑的含藥血清組(P<0.05)，說明加入GDF9受體阻斷劑，GDF9的表達明顯降低，能間接影響經后增殖方含藥血清對Bim基因表達的抑制作用，從而無法維持Bim表達的低水平。

綜上所述，具有益氣血作用的經后增殖方能通過促進GDF9的分泌，維持超排卵大鼠CCs和卵母細胞的功能及其相互之間的促進作用，有利于卵泡的發育，提高卵泡質量；GDF9具有維持CCs中Bim低水平表達的作用。而經后增殖方提高GDF9表達水平的具體作用通路有待進一步研究。

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EffectofserumcontainingJinghouZengzhiRecipeonexpressionofGDF9andBiminovarianCOCsandCCsincontrolledovarianhyperstimulationrats*

YangZhen1，2，GuoXinyu1△，LiuJiazi3，DengWeimin1，ZhangJinyu1

(1.ReproductiveMedicineCenter,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Guangzhou,Guangdong510010,China；2.GraduateSchool,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510405,China；3.DepartmentofRehabilitation,FirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou,Guangdong515041,China)

ObjectiveTo observe the effects of serum containing Jinghou Zengzhi Recipe (JHZZ) on the expression of growth differentiation factor 9 (GDF9) and Bim in cumulus-oocyte complexes (COCs) and cumulus cells (CCs) of controlled ovarian hyperstimulation (COH) rats,and to investigate its curative effect and mechanism.MethodsThe rat COH ovarian model was prepared for collecting COCs and CCs,which were respectively co-cultured in vitro with the blank serum of female COH SD rat and serum containing JHZZ,and the each group was divided into 3 subgroups:the blank serum group (blank group),serum containing JHZZ group (control group) and serum containing JHZZ plus GDF9 receptor blocker group (experimental group),total 6 subgroups.COCs and CCs were collected after 24 h.The expression levels of GDF9 and Bim mRNA were detected by real-time quantitative PCR.The GDF9 protein expression levels were detected by Western blot.Results(1) The expression level of GDF9 mRNA in control group COCs was obviously higher than that in the control group and experiment group COCs (P<0.05);the Bim mRNA expression level in COCs of control group and experiment group was significantly lower than that in COCs of blank group (P<0.05);the GDF9 protein expression level in the control group COCs was significantly higher than that in the blank group COCs (P<0.05),and also higher than that in the experiment group COCs,but the difference was not statistically significant (P>0.05).(2)The comparison results of GDF9 mRNA expression level in CCs among 3 groups were consistent with those in COCs;the Bim mRNA expression level in CCs of control group and experimental group was significantly lower than that in the blank group (P<0.05);the Bim mRNA expression level in the control group CCs was significantly lower than that in the experimental group CCs(P<0.05);the GDF9 protein expression level in the control group CCs was significantly higher than that in the blank group and experimental group CCs (P<0.05).(3)The GDF9 mRNA expression level in the control group COCs was significantly higher than that in CCs (P<0.05),and the other inter-group comparisons between COSs and CCs had no statistical difference (P>0.05).ConclusionSerum containing JHZZ can increase the GDF9 expression level in COCs and CCs,maintain the low expression of Bim in COCs and CCs,inhibit the ovarian cells apoptosis and promote the follicular development;COCs is more conducive to the expression of GDF9 mRNA compared with CCs eliminating oocyte.

Jinghou Zengzhi Recipe；superovulation；cumulus-oocyte complexes；cumulus cells；growth differentiation factor 9；Bim

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.004

國家自然科學基金資助項目(81403249)。

楊貞(1988-)，在讀博士，主要從事婦科生殖醫學方面研究?！?/p>

，E-mail：iris92@126.com。

R285.5

A

1671-8348(2017)35-4908-04

2017-06-25

2017-09-21)