巨噬細胞移動抑制因子在腎癌中的表達及對腎癌細胞侵襲能力的影響*

孫連桃，肖偉利

(1.包頭醫學院醫學技術學院，內蒙古包頭 014040；2.內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特 010017)

·論著·

巨噬細胞移動抑制因子在腎癌中的表達及對腎癌細胞侵襲能力的影響*

孫連桃1，肖偉利2

(1.包頭醫學院醫學技術學院，內蒙古包頭 014040；2.內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特 010017)

目的探討巨噬細胞移動抑制因子(MIF)在腎癌組織中的表達及對腎癌細胞侵襲能力的影響。方法以內蒙古自治區人民醫院和包頭市腫瘤醫院2013年3月至2015年3月病理室確診的49例腎癌患者為研究對象，采用蛋白質印跡法(Western blot)及反轉錄(RT)-PCR法檢測腎癌組織及癌旁正常組織、腎癌細胞株及正常腎小管上皮細胞HK-2中MIF蛋白及mRNA表達；利用脂質體將siRNA MIF及siRNA NC轉染到腎癌細胞中，Western blot及RT-PCR檢測轉染效果，噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力，Transwell法檢測細胞侵襲能力，Western blot檢測細胞中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)及基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達。結果腎癌組織中MIF蛋白及mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織(0.89±0.09vs. 0.18±0.02，1.19±0.04vs. 0.19±0.01，P<0.05)，腎癌細胞株ACHN、769-p、786-O、Caki-1中MIF蛋白及mRNA表達水平明顯高于腎小管上皮細胞HK-2(P<0.05)。與siRNA NC組比較，siRNA MIF組中MIF蛋白及mRNA表達水平明顯下調(P<0.05)，細胞活力及侵襲能力降低(P<0.05)，HIF-1α及MMP9表達水平下調(P<0.05)。結論MIF在腎癌中高表達，下調MIF表達能明顯抑制腎癌細胞的侵襲能力，可能與抑制HIF-1α/MMP9信號通路有關。

腎腫瘤；巨噬細胞移動抑制因子；侵襲

腎細胞癌又稱為腎癌，是泌尿生殖系統中常見的惡性腫瘤，僅次于膀胱癌，其中腎透明細胞癌是最常見的病理類型。近些年來雖然隨著醫學影像技術手段的不斷發展，腎癌的早期診斷率大大提高，但是有部分患者在早期診斷時就發現轉移性病灶，使得5年生存率不足10%[1-2]。因此，尋找更為高效、特異性的早期標記物及探討腎癌的發病機制對于腎癌的診斷及治療將具有積極意義。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種來源于活化的T淋巴細胞、單核/巨噬細胞的多功能因子，受下丘腦垂體控制。近些年研究表明MIF不僅參與機體免疫反應、炎性反應，還在眾多腫瘤的發生、發展中起著促進作用，并與腫瘤的侵襲、浸潤呈正相關，推測MIF是一個潛在的腫瘤標記物[3-5]。另外，有研究表明腎癌患者血清MIF表達水平顯著高于健康對照[6]。本課題組前期也采用免疫組織化學法證實MIF在腎癌組織中高表達，并與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移密切相關，但對于MIF在腎癌發生、發展中的具體作用機制尚未見報道。因此，本研究將采用蛋白質印跡法(Western blot)及實時熒光定量PCR進一步檢測癌組織及癌細胞株中MIF的表達，并探討MIF在腎癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1標本來源 以內蒙古自治區人民醫院和包頭市腫瘤醫院泌尿外科2013年3月至2015年3月病理室確診的49例腎癌患者為研究對象，男30例，女19例；年齡40～74歲，中位年齡57歲，<60歲者20例，≥60歲者29例。收集所有患者腫瘤組織石蠟標本(均為腎透明細胞癌)，另外取相應的腎癌旁正常組織作為對照。所有患者術前均未接受過任何的化療、放療、靶向治療及免疫治療。

1.2細胞株 人腎癌細胞株ACHN及769-p，人腎透明細胞癌細胞株786-O及Caki-1，腎小管上皮細胞HK-2均購自中國科學院細胞庫。

1.3儀器與試劑 噻唑藍(MTT)，DMEM培養基均購自美國Hyclone公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白水平測定試劑盒，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)均購自上海碧云天生物技術有限公司；trizol試劑盒，一步法反轉錄(RT)-PCR試劑盒，LipofectamineTM2000均購自大連寶生生物技術有限公司；siRNA MIF及siRNA NC均購自廣州銳博生物技術有限公司；兔抗人MIF，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)，基質金屬蛋白酶9(MMP9)及3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司。MK3酶標儀購自美國Thermo公司；TS100倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；2720型PCR儀購自美國ABI公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1細胞轉染 當腎癌細胞匯合度達到50%左右時，利用LipofectamineTM2000脂質體將siRNA MIF及siRNA NC轉染到細胞中，6 h以后換液；繼續培養48 h。Western blot及實時熒光定量PCR法檢測細胞中MIF蛋白及mRNA水平。

1.4.2RT-PCR檢測MIF mRNA表達 采用trizol試劑盒提取細胞總RNA，并檢測總RNA純度，以260 nm與280 nm處吸光度值比值(A260/A280)說明RNA純度的良好；接著一步法RT-PCR試劑盒將RNA反轉錄，最后進行實時熒光定量PCR擴增，擴增結果利用2-ΔΔCT法進行分析。MIF上游引物：5′-CAC TGA AGC GGG AAG GGA CT-3′，下游引物：5′-GCG GCG ATA CCG TAA AGC AC-3′；GAPDH上游引物：5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′，下游引物：5′-TGG ACT CCA CGA CGT ACT-3′。

1.4.3Western blot檢測MIF、HIF-1α及MMP9蛋白的表達 在獲得的組織或細胞中加入細胞裂解液，裂解30 min，4 ℃條件下離心得到的上清液就是總蛋白。接著采用BCA試劑盒測定蛋白水平。蛋白煮沸10 min變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳1～2 h，濕法轉膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人MIF、HIF-1α、MMP9及GAPDH多克隆抗，稀釋度為1∶100)孵育，4 ℃過夜；二抗溶液[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)，稀釋度1∶200]室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.4.4MTT法檢測細胞活力 將腎癌細胞接種到96孔板，培養24 h后，按1.4.1方法進行轉染，繼續培養48 h后，加入20 μL MTT，繼續培養4 h，將96孔板中的上清液棄去，再加入150 μL二甲基亞砜，震蕩使結晶物溶解，于酶標儀560 nm波長處測A值，A值即代表細胞活力。

1.4.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 將Transwell小室鋪上Matrigel備用。將腎癌細胞接種到6孔板，24 h后，按1.4.1方法進行轉染，繼續培養48 h后，細胞消化并接種到Transwell上室，而下室僅含有DMEM培養基，繼續培養48 h后，將小室取出，用多聚甲醛固定，結晶紫染色，最后在倒置顯微鏡下觀察細胞侵襲情況，并對下室的5個視野中的細胞數目進行計數，取平均值，即為細胞的侵襲數目。

2 結 果

2.1MIF在腎癌組織及癌旁正常組織中的表達 如圖1所示，Western blot結果顯示腎癌組織中MIF蛋白表達水平(0.89±0.09)明顯高于癌旁正常組織(0.18±0.02)，差異有統計學意義(P<0.05)。如圖2所示，RT-PCR結果顯示腎癌組織中MIF mRNA表達水平(1.19±0.04)明顯高于癌旁正常組織(0.19±0.01)，差異有統計學意義(P<0.05)。

A：癌旁正常組織；B：腎癌組織

圖1腎癌組織及癌旁正常組織中MIF蛋白的表達

A：癌旁正常組織；B：腎癌組織；*：P<0.05，與癌旁正常組織比較

圖2腎癌組織及癌旁正常組織中MIF mRNA的表達

2.2MIF在腎癌細胞株及腎小管上皮細胞HK-2中的表達 如圖3所示，Western blot結果顯示腎癌細胞株ACHN(0.92±0.09)，769-p(0.88±0.09)，786-O(0.80±0.09)，Caki-1(1.15±0.10)中MIF蛋白表達水平明顯高于腎小管上皮細胞HK-2(0.17±0.02)，差異有統計學意義(P<0.05)。如圖4所示，RT-PCR結果顯示腎癌細胞株ACHN(0.59±0.13)，769-p(0.63±0.09)，786-O(1.03±0.09)，Caki-1(1.24±0.09)中MIF mRNA表達水平明顯高于腎小管上皮細胞HK-2(0.18±0.02)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 腎癌細胞株及腎小管上皮細胞HK-2中 MIF蛋白的表達

*：P<0.05，與HK-2比較

圖4腎癌細胞株及腎小管上皮細胞HK-2中MIF mRNA的表達

2.3siRNA轉染效果的測定 腎癌細胞Caki-1轉染siRNA MIF及siRNA NC 48 h后，Western blot結果顯示與siRNA NC組(0.97±0.10)比較，siRNA MIF組(0.16±0.01)中MIF蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖5；RT-PCR結果顯示與siRNA NC組(1.15±0.15)比較，siRNA MIF組(0.36±0.03)中MIF mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖6。

A：siRNA NC組；B：siRNA MIF組

圖5 siRNA轉染后腎癌細胞Caki-1中MIF蛋白的表達

A：siRNA NC組；B：siRNA MIF組；*：P<0.01，與siRNA NC組比較

圖6 siRNA轉染后腎癌細胞Caki-1中MIF mRNA的表達

2.4siRNA MIF對腎癌細胞活力的影響 腎癌細胞株Caki-1轉染siRNA MIF及siRNA NC 48 h后，MTT法檢測結果顯示與siRNA NC組(0.68±0.06)比較，siRNA MIF組(0.32±0.03)細胞活力明顯降低(P<0.05)，見圖7。

2.5siRNA MIF對腎癌細胞侵襲能力的影響 腎癌細胞株Caki-1轉染siRNA MIF及siRNA NC 48 h后，Transwell實驗結果顯示與siRNA NC組(138.95±13.40)比較，siRNA MIF組(42.19±4.21)細胞遷移數目明顯減少(P<0.05)，見圖8。

2.6siRNA MIF對腎癌細胞中HIF-1α及MMP9表達的影響 腎癌細胞株Caki-1轉染siRNA MIF及siRNA NC 48 h后，Western blot結果顯示與siRNA NC組比較，siRNA MIF組HIF-1α[(0.73±0.06)vs.(0.18±0.02)]及MMP9[(0.70±0.07)vs.(0.20±0.02)]表達水平明顯下調(P<0.05)，見圖9。

A：siRNA NC組；B：siRNA MIF組；*：P<0.01，與siRNA NC組比較

圖7 siRNA MIF對腎癌細胞活力的影響

A：siRNA NC組；B：siRNA MIF組

圖8 siRNA MIF對腎癌細胞侵襲能力的影響

(結晶紫染色，×200)

A：siRNA NC組；B：siRNA MIF組

圖9 siRNA MIF對腎癌細胞中HIF-1α及MMP9表達的影響

3 討 論

MIF是1970年學者在遲發型反應研究中發現的一種能夠抑制巨噬細胞移動的因子，位于人第22號染色體上。MIF來源于活化的T淋巴細胞，能夠表達于腎小管上皮細胞、肝細胞、表皮細胞等，能通過內分泌或者旁分泌促進多種細胞因子的分泌，進而引起各種免疫或炎性反應[3-4]。近年來，研究還證實MIF在肝癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達，對腫瘤的發生、發展起著促進作用，被認為是一種促癌因子[7-9]。另外，2013年Du等[6]利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)證實了腎透明細胞癌患者血清中MIF表達水平顯著高于健康對照組。本研究前期免疫組織化學結果也證實腎癌組織中MIF陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，而且MIF的表達與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移密切相關。提示MIF在腎癌的發生、發展中也起著推動作用，可能是腎癌潛在的早期標記物，但是MIF在腎癌的發生、發展中的作用機制尚未見報道，所以本課題組對此展開研究。本研究首先采用Western blot及RT-PCR法檢測腎癌及癌旁正常組織中MIF蛋白及mRNA的表達，結果與本課題組前期免疫組織化學結果及Du等[6]研究結果一致，MIF在腎癌組織中高表達。接著，繼續采用Western blot及實時熒光定量PCR法檢測腎癌細胞株及正常腎小管細胞HK-2中MIF的表達，結果表明腎癌細胞株中MIF蛋白及mRNA表達水平均明顯高于HK-2，與MIF在組織中的表達趨勢一致[7-9]。進一步說明MIF在腎癌的發生、發展中起著促進作用，提示通過干擾并下調腎癌中MIF的表達進而抑制腎癌的發生、發展。因此，本研究首先利用脂質體將siRNA MIF及siRNA NC轉染到腎癌細胞Caki-1中，并證實轉染成功。接著利用MTT法證實siRNA MIF能顯著降低Caki-1細胞活力，與Du等[6]采用發夾RNA干擾腎癌細胞中MIF表達，能顯著降低細胞活力及細胞克隆形成能力的研究結果一致。從而說明下調腎癌細胞中MIF表達，能顯著抑制腎癌細胞的增殖。

隨著腫瘤惡性程度的加深，腫瘤細胞代謝越加旺盛，進而使得腫瘤細胞處于缺血、缺氧的微環境中，因此為了使細胞能夠適應此微環境，腫瘤內部會對低氧環境做出反應以滿足細胞穩定快速的生長。其中HIF-1α是一種為適應缺氧微環境而產生的核轉錄調控因子，在正常氧環境下，HIF-1α被降解，表達水平極低，而在低氧環境下，HIF-1α呈倍數的增長，并結合于靶基因的低氧反應元件，調控靶基因的轉錄活性，進而促進腫瘤的糖代謝，血管生成，細胞增殖及侵襲轉移等[10-11]。研究已經顯示，HIF-1α在眾多腫瘤組織中高表達，并且MIF的存在能夠抑制HIF-1α的降解及突變，進而促進腫瘤細胞的快速生長與浸潤[10-11]。另外腫瘤的侵襲轉移是影響腎癌患者術后預后的重要因素之一，而腫瘤的侵襲轉移涉及腫瘤細胞穿過細胞外基質、血管壁基膜等過程，而MMPs是介導細胞外基質降解，促使腫瘤細胞穿膜的最為主要的蛋白水解酶[12-13]。其中MMP9是MMPs家族最大的水解酶，能夠降解包括Ⅳ型膠原在內的最為重要的基質成分。而且研究表明，MMP9基因的5′UTR區域存在著HIF-1α的結合位點，HIF-1α對于MMP9具有顯著的調控作用，如研究證實通過調控HIF-1α/MMP9途徑能夠顯著抑制胃癌的生長及侵襲[14]。同時研究還表明，MIF能直接調控MMPs表達進而影響腫瘤細胞的侵襲轉移，如RNA干擾口腔鱗狀細胞Tca8113、HN5及SCC25中MIF表達，能顯著下調MMP9表達，繼而抑制癌細胞侵襲[15]。說明MIF可能通過調控HIF-1α/MMP9通路進而影響腎癌細胞的生長侵襲。所以本研究繼續利用Western blot檢測siRNA MIF對Caki-1細胞中HIF-1α、MMP9表達水平的影響，結果表明siRNA能顯著下調HIF-1α及MMP9表達。

綜上所述，MIF在腎癌組織及腎癌細胞(ACHN、769-p、786-O、Caki-1)中高表達，利用RNA干擾Caki-1腎癌細胞中MIF表達，能顯著下調MIF蛋白及mRNA表達，并降低細胞活力及侵襲能力，可能與抑制HIF-1α/MMP9信號通路有關。

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Expressionofmacrophagemigrationinhibitoryfactorinrenalcarcinomaanditseffectoninvasionabilityofrenalcarcinomacell*

SunLiantao1，XiaoWeili2

(1.SchoolofMedicalTechnology,BaotouMedicalColloge,Baotou,InnerMongolia014040,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,InnerMongoliaAutonomousRegionPeople′sHospital,Hohhot,InnerMongolia010017,China)

ObjectiveTo explore the expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in renal carcinoma tissue and its effect on invasion of renal carcinoma cell.MethodsForty-eight cases of patients definitely diagnosed with renal cancer in the Department of Pathology,the Inner Mongolia Autonomous Region People′s Hospital and Baotou Municipal Tumor Hospital from March 2013 to March 2015 served as the research subjects.The expressions of MIF protein and mRNA in renal carcinoma tissues and adjacent normal tissues,renal carcinoma cell lines and normal renal tubular epithelial cells HK-2 were detected by adopting the Western blot and RT-PCR.siRNA MIF and siRNA NC were transfected into renal carcinoma cells by liposome.The transfection effect was detected by Western blot and RT-PCR.The cell viability and invasion ability were measured by MTT and Transwell method respectively.The expression of hypoxia inducible factor 1-alpha (HIF-1α) and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) was measured by Western blot.ResultsThe expression levels of MIF protein and mRNA in renal carcinoma tissues were significantly higher than those in adjacent normal tissues (0.89±0.09vs. 0.18±0.02，1.19±0.04vs. 0.19±0.01，P<0.05).The expression levels of MIF protein and mRNA in renal cancer cell line ACHN，769-p，786-O，Caki-1 cells were higher than those in renal tubular epithelial HK-2 cells (P<0.05).Compared with the siRNA NC group,the expression levels of MIF protein and mRNA in siRNA MIF group were significantly down-regulated (P<0.05),the cell viability and invasion ability were reduced (P<0.05),and the expressions of HIF-1α and MMP9 were down regulated (P<0.05).ConclusionMIF is highly expressed in renal carcinoma,down-regulating MIF expression can significantly inhibit the renal cancer cell invasion,which might be related with inhibiting HIF-1α/MMP9 signaling pathway.

kidney neoplasms；macrophage migration inhibitory factor；invasion

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.001

內蒙古自治區自然科學基金(2014MS0807)。

孫連桃(1972-)，副教授，碩士，主要從事醫學檢驗研究。

R737.11

A

1671-8348(2017)35-4897-04

2017-06-26

2017-09-12)