混合共培養條件下骨髓間充質干細胞與脂肪間充質干細胞成骨性能分析

王小偉，高春生，晏慧超，李勇光

(湖北省第三人民醫院骨科，湖北 武漢 430033)

實驗研究

混合共培養條件下骨髓間充質干細胞與脂肪間充質干細胞成骨性能分析

王小偉，高春生*，晏慧超，李勇光

(湖北省第三人民醫院骨科，湖北 武漢 430033)

目的探討混合共培養條件下骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)和脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC)成骨分化潛能變化。方法無菌條件下獲取BMSC和ADSC，純化后倒置顯微鏡下觀察細胞形態，對兩種細胞分別進行成脂肪誘導、成軟骨、成骨誘導，分別利用油紅O染色、甲苯胺藍染色、茜素紅染色進行鑒定。實驗分四組：A組：BMSC+ADSC未誘導(BMSC︰ADSC=1︰1)；B組：BMSC誘導組；C組：ADSC誘導組；D組：BMSC+ADSC誘導組(BMSC︰ADSC=1︰1)。誘導組采用成骨誘導液進行成骨誘導，體外培養14d后Real-time PCR檢測骨鈣素(osteocalcin，OCN)及Runt相關轉錄因子2(Runx-2)基因表達情況，以及通過Western-blot法檢測OCN及Runx-2蛋白表達情況。結果兩種細胞在體外誘導后油紅O染色、甲苯胺藍染色、茜素紅染色均為陽性，q-PCR結果顯示D組OCN及Runx-2表達量明顯高于A、B、C組(P<0.05)，Western-blot結果顯示OCN及Runx-2蛋白表達量D組明顯高于其他三組P<0.05)。結論BMSC與ADSC在體外混合共培養條件下可促進干細胞的成骨性能。

骨髓間充質干細胞；脂肪間充質干細胞；混合培養；成骨潛能

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)和脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC)都屬于成體干細胞。骨髓作為成體干細胞的來源已經被廣泛認知，BMSC具有多向分化潛能，然而BMSC在骨髓中含量極低，僅有0.01～0.001%，并且來源有限[1]。因此，有效提高BMSC在生物工程中的利用率十分必要。而脂肪是近年來研究較為熱門的干細胞來源。與骨髓相比，脂肪組織能夠通過較小創傷的方法分離并獲得數目更多的脂肪來源干細胞[2]。目前關于二者成骨性能已有廣泛研究，然而將二者進行接觸混合培養條件下觀察二者的成骨性能鮮有報道。本實驗擬通過將BMSC與ADSC進行接觸共培養，觀察二者在成骨性能上的變化，以期為組織工程種子細胞的選擇提供新的視角。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 8周齡SD大鼠，雌雄不限，150～200g(上海交通大學動物實驗中心提供)；低糖Dulbecco氏培養基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)(hyclone)；hyclone胎牛血清；胰酶、Ⅰ型膠原酶(hyclone)；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(millipore)，轉化生長因子β1(transforming growth factor beta，TGF-β1)，堿性磷酸酶，油紅O，茜素紅(sigma公司)，骨鈣素(osteocalcin，OCN)一抗，RUNX2一抗(abcam)，二抗IgG-HRP(Biosharp BL002A，millipore)。

1.2 原代細胞的提取 按照文獻[3]的方法進行原代提取，無菌條件下分別獲取大鼠下肢骨以及腹股溝處脂肪組織，貼壁法和酶消化法獲取原代細胞，當原代細胞融合至80%時進行傳代培養。

1.3 原代細胞的鑒定 根據文獻[3]，分別將ADSC與BMSC向成脂肪、成軟骨、成骨方向誘導，并分別利用油紅O染色、甲苯胺藍染色、茜素紅染色鑒定。

1.4 實驗分組及成骨誘導 實驗分四組，A組：BMSC+ADSC未誘導組；B組：BMSC誘導組；C組：ADSC誘導組；D組：BMSC+ADSC誘導組(BMSC︰ADSC=1︰1)。A組BMSC與ADSC細胞密度均為5.0×104/孔，BMSC︰ADSC=1︰1，普通培養液培養14 d；B、C組細胞密度為1.0×105/孔，進行體外成骨誘導14 d，D組BMSC與ADSC細胞密度均為5.0×104/孔，BMSC︰ADSC=1︰1，成骨誘導液培養14 d。成骨誘導液成分為：10%FBS的DMEM培養液，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.05 mmol/L維生素C和100 mmol/L地塞米松。

1.5 Real-time PCR檢測OCN和Runx2 mRNA表達 14d向各組細胞加入Trizol 試劑提取總RNA，用real time-PCR Kit(Takara 公司)逆轉錄成cDNA，利用SYBR green I real time PCR Kit(TaKaRa 公司)試劑盒擴增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參(見表1)。

表1 各基因引物序列

1.6 Western blot 法檢測成骨特異性蛋白OCN與Runx2蛋白表達 14d后將各組細胞取出，充分研磨，3 mL/g蛋白裂解液充分裂解后，100 00 g離心30 min。BCA法測定總蛋白濃度。分別進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗孵育過夜，二抗1︰100 00孵育4 h，加入顯色劑顯色，內參GAPDH。凝膠成像系統成像，Image J軟件計算灰度值。相對灰度值=[目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值]×100%。

2 結 果

2.1 原代細胞形態學觀察及細胞鑒定 BMSC原代培養4～6 h后開始貼壁，細胞大小不均勻，起初為多角形，梭形，3 d后類成纖維細胞明顯增多，4～5 d細胞進入對數生長期，6～7 d細胞融合接近80%。ADSC原代培養72 h后，細胞形態呈紡錘狀或不規則形態；5～8 d后細胞逐漸形成分散的細胞集落，其形態多為成纖維樣細胞樣。成脂誘導后油紅O染色可見紅染的脂滴，成軟骨誘導后甲苯胺藍染色可見細胞質藍染，成骨誘導后茜素紅染色可見紅色鈣化灶(見圖1)。

2.2 Real-time PCR檢測OCN和Runx2 mRNA表達 為了從分子水平了解混合培養后兩種干細胞的成骨性能，本實驗利用Real-time PCR檢測成骨特異性基因OCN和Runx2 mRNA表達，結果顯示，混合培養后D組OCN和Runx2 mRNA表達量明顯高于A、B、C組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

a BMSC/ADSC原代細胞(倒置相差顯微鏡，×10)

b BMSC/ADSC成脂肪誘導油紅O染色(倒置相差顯微鏡，×20)

c BMSC/ADSC成軟骨誘導甲苯胺藍染色(倒置相差顯微鏡，×40)

d BMSC/ADSC成骨誘導茜素紅染色(倒置相差顯微鏡，×10)

表2 Real-time PCR檢測的各組OCN和Runx2 mRNA表達比較

2.3 Western blot 法檢測成骨特異性蛋白OCN與Runx2蛋白表達 為了解混合培養后兩種干細胞誘導成骨后蛋白水平的表達，本實驗利用Western blot法檢測成骨特異性蛋白OCN和Runx2表達，結果顯示，混合培養后D組OCN和Runx2蛋白表達水平明顯高于A、B、C組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3，見圖2)。

表3 Western blot法檢測的各組OCN與Runx2蛋白表達比較

圖2 OCN和Runx2蛋白相對表達

3 討 論

骨缺損導致的畸形是臨床上常見難題[4]，目前，常用的修復骨缺損方法為自體骨移植和異體骨移植，但都有各自的局限性，如自體骨移植會導致術區創傷，且骨量受限，異體骨移植則可能出現排斥反應[5]。生物工程的出現為骨缺損的修復指明了新的方向，而種子細胞的選擇是生物工程技術的關鍵[6]。骨髓是人們研究最早的成體干細胞來源之一，骨髓間充質干細胞來源于骨髓并且具有多向分化潛能，然而BMSC在骨髓中含量很低，僅有0.01%～0.001%，并且需要進行有創方法才能獲取骨髓組織，無疑加重了患者的承受負擔[1]。因此，有效提高BMSC在生物工程中的利用率十分必要。而脂肪是近年來研究較為熱門的干細胞來源。與骨髓相比，脂肪組織能夠通過較小創傷的方法分離并獲得數目更多的脂肪來源干細胞。已有研究表明，BMSC在目前所知的成體干細胞領域具有更高的成骨能力[3]，然而如何提高BMSC的成骨效率目前仍鮮有研究報道。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)具有多向分化潛能，研究表明，MSC可向成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、肝細胞等多種終末分化細胞分化[7]。本實驗通過提純后將兩種原代細胞分別進行成脂肪、成軟骨和成骨誘導，分別進行油紅O染色、甲苯胺藍染色和茜素紅染色，結果發現兩種細胞在成脂肪誘導條件下可轉換成脂肪細胞，成軟骨誘導后甲苯胺藍染色陽性，而成骨誘導后可生成鈣化灶，提示BMSC與ADSC具有多向分化潛能。

OCN由成骨細胞合成與分泌，是骨細胞外基質最主要的非膠原蛋白并參與骨質形成[8-9]。而且間充質干細胞成骨誘導后也有OCN受體的表達[10]。OCN作為成體干細胞向軟骨細胞/成骨細胞樣細胞分化的礦化指標，參與骨細胞的礦化，并可能在骨質形成過程中調節晶體生長[11]。本實驗通過研究發現，通過將BMSC與ADSC混合共培養并進行成骨后，其OCN mRNA表達量明顯提高，為了從蛋白水平觀察二者成骨效果，本實驗利用Wstern blot法檢測OCN蛋白水平，發現混合培養后兩種細胞OCN表達量明顯高于其他三組，展現了更好的成骨能力。

Runx2是成骨細胞(osteoblast，OB)分化必需的轉錄因子，調控多種與成骨和成牙本質相關基因的表達[12]。并且，Runx2是成骨分化特異性轉錄因子，能提高前成骨細胞、軟骨細胞中與礦化相關蛋白的基因轉錄，使其向成骨細胞分化[13]。因此，Runx2的表達是成骨細胞開始分化的標志，誘導MSC骨向分化。此外，有研究顯示，Runx2基因的缺失將導致骨發育不良或終止[14-15]。相對高表達的Runx2也可促進新生成骨細胞的分泌和成熟，Benson等[16]研究發現，Runx2基因與成骨細胞特異順式作用元件(osteoblast-specific cis-acting element，OSE)結合后可激活骨鈣蛋白(osteocalcin)、骨橋素(osteopontin)、骨涎蛋白(bonesialopmtein)以及I型膠原(Type Ⅰ collagen)基因的轉錄和表達。本實驗通過研究發現，通過將BMSC與ADSC混合共培養并進行成骨后，其Runx2 mRNA表達量明顯提高，為了從蛋白水平觀察二者成骨效果，本實驗利用Wstern blot法檢測Runx2蛋白水平，發現混合培養后兩種細胞Runx2表達量明顯高于其他三組，提示混合培養后兩種間充質干細胞具有更好的成骨分化潛能。

綜上所述，將BMSC與ADSC混合共培養后，其OCN和Runx2基因和蛋白水平明顯提升，較單種成體干細胞具有更高的成骨潛能，為生物工程種子細胞的選擇提供了新的思路。

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OsteogenicDifferentiationCapacityofMixedCulturedBoneMarrowMesenchymalStemCellsandAdipose-derivedMesenchymalStemCells

Wang Xiaowei，Gao Chunsheng，Yan Huichao，et al

(Orthopedics Department，Third People's Hospital of Hubei Province，Wuhan 430033，China)

ObjectiveTo assess the osteogenic differentiation in the condition of co-culture of BMSC and ADSC.MethodsADSC and BMSC obtained under sterile conditions.Oil red O was used to identify two cells after being induced into fat.Toluidine blue staining was used to identify two cells after being induced into Chondrocytes.Alizarin red staining were used in osteogenic induction group.Osteogenic induction group was divided into four sub-groups，group A：BMSC+ADSC uninduced group(BMSC：ADSC=1︰1)；group B：BMSC induced group；group C：ADSC induced group；group D：BMSC+ADSC induced group(BMSC：ADSC=1︰1).OCN and RUNX2 mRNA expression were detected by qPCR after osteogenic induction for 14 days，while the protein expression of OCN and RUNX2 were tested by Western blot at the same time.ResultsOil red O staining，Toluidine blue staining and Alizarin red staining showed positive results.The mRNA expression and protein expression of OCN and RUNX2 were significiantly higher than the other three groups after osteogenic induction for 14 days in vitro.ConclusionThe ability of osteogenic potential strengthened to some extent under the condition of co-culturing.

bone mesenchymal stem cells；adipose-derived mesenchymal stem cells；co-cultured；osteogenic potential

湖北省科技計劃項目(2013CKB030)；*本文通訊作者：高春生

王小偉，高春生，晏慧超，等.混合共培養條件下骨髓間充質干細胞與脂肪間充質干細胞成骨性能分析[J].實用骨科雜志，2017，23(11)：1091-1094.

1008-5572(2017)12-1091-04

R329.5

A

2017-05-09

王小偉(1976- )，男，主治醫師，湖北省第三人民醫院骨科，430033。