胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白表達與胃癌患者預后的關系

韓新影，劉紅正，李秀清，鞠英博，李艷艷，張志剛

(1.滄州市人民醫院病理科，河北 滄州 061001；2.滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061001)

胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白表達與胃癌患者預后的關系

韓新影1，劉紅正2，李秀清1，鞠英博1，李艷艷1，張志剛1

(1.滄州市人民醫院病理科，河北 滄州 061001；2.滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061001)

目的檢測胃癌組織及癌旁組織中VGLL4、YAP蛋白的表達情況，探討其在胃癌診治中的臨床意義。方法采用免疫組織化學SP法檢測46例胃癌組織及癌旁組織中VGLL4、YAP蛋白的表達情況,分析其表達與胃癌患者預后的相關性。結果胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白的陽性表達率分別為39.1%(18/46)，76.1%(35/46)，癌旁組織中的陽性表達率分別為91.3%(42/46)、10.9%(5/46)，差異有統計學意義(P＜0.05)。VGLL4和YAP蛋白的表達均與胃癌組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移、侵襲性具有相關性(P＜0.05)，且與患者預后相關。YAP陽性表達高水平胃癌患者術后中位生存時間[(19.000±0.557)個月]明顯短于YAP陽性表達低水平胃癌患者[(36.000±2.942)個月]，VGLL4陽性表達低水平胃癌患者術后中位生存時間[(18.000±1.503)個月]明顯短于VGLL4陽性表達高水平胃癌患者[(26.000±2.863)個月]，YAP和VGLL4表達水平均與胃癌患者預后明顯相關，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論VGLL4在胃癌組織中較癌旁組織表達下降，且與腫瘤發展和惡性程度呈負相關，是一種潛在的抑癌蛋白。YAP在胃癌組織中較癌旁組織表達增高，與腫瘤發展和惡性程度呈正相關，且兩者均與患者預后相關。

胃癌；免疫組化；VGLL4；YAP

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。侵襲和轉移是胃癌惡性生物學行為的重要特征，是一個多步驟、多因素參與的復雜過程，是導致胃癌患者預后差和死亡的主要原因[1-3]。研究表明，Hippo通路可以調控細胞增殖和凋亡，YAP是其主要的效應分子，YAP基因突變或表達異常引起的Hippo-YAP通路的調控失常可導致細胞增殖、凋亡失衡和腫瘤的形成[4]。轉錄輔助因子退變樣蛋白4(VGLL4)是VGLL的家族成員之一，VGLL4可以搶先一步控制YAP的活性“開關”，從而抑制腫瘤細胞生長。研究者發現，VGLL4蛋白在胃癌組織中明顯減少，且與腫瘤的發展及惡化明顯負相關，是一種潛在的抑癌蛋白，且癌細胞對于該多肽抑制劑的敏感性與癌細胞本身的YAP/VGLL4蛋白比率成正相關[5]。本研究采用免疫組化檢測胃癌組織中VGLL4、YAP蛋白的表達情況，分析其表達與胃癌患者臨床病理參數及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自滄州市人民醫院病理科2015年6月至2016年6月存檔的胃癌組織及對應癌旁組織(距離癌組織＞5 cm)的石蠟包埋組織46例，重新制備4 μm切片，HE染色，由兩名有經驗的診斷醫師進行審核及組織學分型。其中女性19例，男性27例，年齡24～89歲，平均60.5歲，組織學分型及臨床分期不等。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學方法兔抗人YAP多克隆抗體，VGLL4單克隆抗體(bs-3605R，bs-9185R)，均購自北京博奧森生物技術有限公司。免疫組織化學SP法嚴格按照試劑說明的要求進行，YAP一抗稀釋濃度為1：100，VGLL4一抗稀釋濃度為1：200，用已知陽性組織切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照，同時每例取一張切片做HE染色觀察形態。

1.2.2 免疫組化結果判定標準 VGLL4、YAP，蛋白著色部位為胞核，少數病例可見胞漿著色。采用陽性細胞比例和著色強度兩項計分法綜合評定陽性結果，即首先將染色強度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。將陽性細胞百分比分成5級：無陽性細胞為0分，陽性細胞＜25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度積分和數量積分相加：0分為-，2～3分為±，4～5分為+，6～7分為++，其中+、++判讀為陽性。所有胃癌患者被分為兩組，＜4分被認為低表達組，≥4分被認為是高表達組。

1.2.3 臨床病理資料 按照不同的臨床病理參數進行分組，其中臨床分期采用外科常用的TNM分期法，組織學分級采用楊軍等提出的一種新型胃癌組織學分型、分級-評分系統[6]：G1≤4分；G2 5～7分；G3≥8分。應用Kaplan-Meier生存曲線分析VGLL4、YAP蛋白表達與胃癌患者生存時間的關系，所選46例患者均具有完整的隨訪資料，術后第一年每2個月隨訪一次，以后每半年隨訪一次，隨訪主要以門診復查和電話隨訪為主。

1.3 統計學方法應用SPSS20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，采用t檢驗；計數資料的描述統計量以率表示，采用χ2檢驗。生存率的計算采用Kaplan-meier法，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗，VGLL4和YAP的表達相關性采用Spearman's雙變量相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VGLL4、YAP蛋白在胃癌及癌旁組織中陽性免疫反應定位及表達情況 VGLL4蛋白主要在周圍胃黏膜組織中的胞核表達，呈棕黃色顆粒，在胃癌組織中表達減少甚至無表達；YAP蛋白在胃癌組織中主要在胞核和(或)胞質表達，呈棕黃色顆粒，小部分胃癌組織及周圍正常胃黏膜組織中未見表達(圖1)。VGLL4蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況分別為 39.1%(18/46)和 91.3%(42/46)(χ2=25.348，P＜0.001)，YAP蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況分別為76.1%(35/46)和10.9%(5/46)，差異均有統計學意義(χ2=39.808，P＜0.001)。

2.2 VGLL4和YAP蛋白表達與臨床病理參數的關系 VGLL4和YAP的異常表達均與胃癌組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移、侵襲性具有顯著相關性(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小并無顯著相關性(P＞0.05)，見表1。

圖1 VGLL4和YAP在胃癌組織和癌旁組織中的表達（SP法×100）

表1 YAP和VGLL4蛋白表達與46例胃癌患者臨床病理特征的關系(n=46)

2.3 VGLL4和YAP蛋白表達與胃癌患者預后的相關性 YAP陽性表達高水平胃癌患者術后中位生存時間[(19.000±0.557)個月]明顯短于YAP陽性表達低水平胃癌患者[(36.000±2.942)個月]，統計學分析結果顯示YAP表達水平與胃癌患者預后相關(t=-38.636，P＜0.05)。VGLL4陽性表達低水平胃癌患者術后中位生存時間[(18.000±1.503)個月]明顯短于VGLL4陽性表達高水平胃癌患者[(26.000±2.863)個月]，統計學分析結果顯示VGLL4表達水平與胃癌患者預后相關(t=16.779，P＜0.05)。

2.4 YAP和VGLL4在胃癌組織中表達的相關性 在YAP陽性表達高水平的35例胃癌組織中，VGLL4陽性表達高水平者10例，VGLL4陽性表達低水平者25例。在YAP陽性表達低水平的11例胃癌組織中，VGLL4陽性表達高水平者8例，VGLL4陽性表達低水平者3例。同時，在VGLL4陽性表達高水平的18例胃癌組織中，YAP陽性表達高水平者10例，YAP陽性表達低水平者8例。在VGLL4陽性表達低水平的28例胃癌組織中，YAP陽性表達高水平者25例，YAP陽性表達低水平者3例。在Spearman's相關分析顯示，YAP和VGLL4在胃癌組織中的表達呈負相關(rs=0.386，P＜0.05)，見表2。VGLL4和YAP蛋白表達不同水平胃癌患者生存曲線見圖2。

表2 VGLL4和YAP在46例胃癌患者中表達的相關性

圖2 YAP和VGLL4表達水平對胃癌患者術后生存的影響

3 討 論

胃癌是我國臨床常見的消化道惡性腫瘤，占全部腫瘤死亡率的20%以上[7]，對人來健康構成極大威脅。胃癌發生的分子機制涉及多個癌基因及抑癌基因的表達，研究胃癌發生發展的基因及蛋白表達產物，有助于進一步明確胃癌發生的分子機制，提高胃癌分子診斷，發現胃癌治療的新靶點。

YAP蛋白是Hippo信號通路中一種起關鍵作用的連接蛋白和轉錄共激活因子，通過控制細胞凋亡和增殖之間的平衡，從而調控器官大小和腫瘤的增殖。Hippo-YAP信號通路是近年來發現的一條重要抑癌通路，通過一系列磷酸化負性調控下游YAP蛋白來抑制細胞生長，誘導細胞凋亡和調控器官大小[8]。正常情況下，YAP在正常組織中呈不表達或低表達狀態，一旦上游或下游分子發生突變，這些分子就會激活原先不表達的YAP，作為轉錄共激活因子與TEAD1結合誘導靶基因表達，從而發揮調控細胞增殖和凋亡，上皮間質化轉移與癌變的作用，產生腫瘤[9-11]。與本文研究結果一致，胃癌組織中YAP蛋白表達水平較癌旁組織顯著增加，且與胃癌患者組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移和侵襲性相關，生存曲線顯示YAP蛋白高表達者生存期短于YAP蛋白低表達者，從而證實YAP在胃癌組織中作為一種原癌蛋白發揮作用。是腫瘤治療的潛在分子靶點，因此靶向YAP的抑制劑可能會更有效直接地糾正失調的Hippo信號通路，殺死腫瘤。

轉錄輔助因子退變樣蛋白4(VGLL4)是VGLL家族成員之一，是最新發現的原癌蛋白YAP的拮抗因子，VGLL4通過直接競爭與YAP綁定TEADs對過度激活的YAP-TEAD信號的胃癌細胞增殖和侵襲的抑制劑作用，有效地抑制腫瘤的形成及發展[12-13]，是一種潛在的抑癌蛋白，且癌細胞對于該多肽抑制劑的敏感性與癌細胞內YAP/VGLL4蛋白比率呈正相關。本研究顯示胃癌組織中VGLL4表達較癌旁組織中降低，且VGLL4蛋白的表達與胃癌的組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移和侵襲性呈負相關，生存曲線顯示VGLL4蛋白低表達者生存期短于VGLL4蛋白高表達者。進一步證實VGLL4蛋白表達與胃癌患者預后的關系。且相關性分析顯示VGLL4與YAP蛋白表達負相關。但是由于本研究標本量有限，未涉及到分子水平的研究，VGLL4和YAP蛋白的具體的相互作用機制仍不明確，需要進一步研究。

綜上所述、VGLL4、YAP蛋白的表達可以有效反映腫瘤細胞增殖，侵襲和轉移的情況，進一步判斷患者的預后，胃癌術后檢測VGLL4、YAP蛋白的表達水平，可以一定程度反映胃癌的生物學特征，為臨床治療提供指導，為胃癌及其相似腫瘤患者提供新的治療思路，準確判斷胃癌患者的臨床預后，指導術后臨床治療，提高患者的生活質量，促進康復。

[1]Hwang I,Kang YN,Kim JY,et al.Progonostic significance of membrane-associated mucins 1 and 4 in gastric adenocarcinoma[J].Exp ther Med,2012,4(2):311-316.

[2]Guo J,Dong B,Ji JF,et al.Myofibrillogenesis regulator overexpression is assosiated with poor prognosis of gastric cancer patients[J].World J Gastroenterol,2012,18(38):5434-5441.

[3]徐進,王斌,陳珺,等.基質金屬蛋白酶-11在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系[J].胃腸病學和肝病學雜志,2016,25(6):630-632.

[4] Fernandez-LA,Kenney AM.The Hippo in the room:a new look at a key pathway in cell growth and transformation[J].Cell Cycle,2010,9(12):2292-2299.

[5]Jiao S,Wang H,Shi Z,et al.A peptide mimicking VGLL4 function acts as a YAP antagonist therapy against gastric cancer[J].Cancer Cell,2014,25(2):166-180.

[6]楊軍,劉妮,康安靜,等.一種新型胃癌組織學分型、分級-評分系統[J].臨床與實驗病理學雜志,2013,29(2):159-162.

[7] 黃有群.局部晚期胃癌術前新輔助治療臨床研究[J].重慶醫學,2011,40(27):2773-2774.

[8]Zhao B,Lei QY,Guan KL.The Hippo-Yap pathway:new connection between regulation of organ size and cnacer[J].Curr Opin Cell Biol,2008,20(6):638-646.

[9]Baia GS,Caballero OL,Orr BA,et al.Yes-associated protein 1 is activated and functions as an oncogene in meningiomas[J].Mol Cancer Res,2012,10(7):904-913.

[10]Serrano I,Mcdonald PC,Lock F,et al.Inactivivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase[J].Nat Commun,2013,4:2976.

[11]Harvey KF,Zhang X,Thomas DM.The Hippo pathway and human cancer[J].Nat Rev Cancer,2013,13(4):246-257.

[12]Li N,Yu N,Wang J,et al.miR-222/VGLL4/YAP-TEAD1 regulatory loop promotes proliferation and invasion of gastric cancer cells[J].Am J Cancer Res,2015,5(3):1158-1168.

[13]Jiao S,Wang H,Shi Z,et al.A peptide mimicking VGLL4 function acts as a YAP antagonist therapy against gastric[J].Cancer Cell,2014,25(2):166-180.

Relationship between the expression of VGLL4 and YAP protein in gastric cancer tissue and prognosis of patients with gastric cancer.

HAN Xin-ying1,LIU Hong-zheng2,LI Xiu-qing1,JU Ying-bo1,LI Yan-yan1,ZHANG Zhi-gang1. 1.Department of Pathology,the People's Hospital of Cangzhou City,Cangzhou 061001,Hebei,CHINA;2.Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Cangzhou 061001,Hebei,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of vestigial-like family member 4(VGLL4)and yes-associated protein(YAP)in gastric cancer tissue and paracancerous tissue,and to analyze its clinical significance in the diagnosis and treatment of gastric cancer.MethodsThe expression of VGLL4 and YAP protein in 46 cases of gastric carcinoma and paracancerous tissue were detected by SP immunohistochemical method,and the correlation between the expression and prognosis of patients was analyzed.ResultsThe positive expression rates of VGLL4 and YAP protein were respectively 39.1%(18/46)and 76.1%(35/46)in gastric cancer tissues versus 91.3%(42/46)and 10.9%(5/46)in paracancerous tissues(P＜0.05).The expression of VGLL4 and YAP protein were correlated with the histological grade,clinical stage,lymph node metastasis and invasion(P＜0.05),and correlated with the prognosis.The median survival of patients with high level of YAP positive expression was(19.000±0.557)months,which was significantly shorter than(36.000±2.942)months of the patients with low levels of YAP positive expression(P＜0.05);the median survival of patients with low level of VGLL4 positive expression was(18.000±1.503)months,which was significantly shorter than(26.000±2.863)months of the patients with high levels of VGLL4 positive expression(P＜0.05).ConclusionCompared with the adjacent tissue,the expression of VGLL4 in gastric cancer tissue shows a significant downward trend,and the degree of tumor development and malignancy is negatively correlated with the expression of VGLL4,as a potential anti-cancer protein.YAP is a proto-oncogene,which is highly expressed in gastric cancer tissues,and positively correlated with tumor progression and malignancy.The expression of VGLL4 andYAPprotein is correlated with the prognosis of gastric cancer.

Gastric cancer;Immunohistochemistry;Vestigial-like family member 4(VGLL4);Yes-associated protein(YAP)

張志剛。E-mail：zhzhg001518@126.com

R735.2

A

1003—6350（2017）23—3883—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.032

2017-03-29)