USP22蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

羅錚錚，楊小敏

(1.惠州市中心人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 惠州 516001；2.惠州市第一人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 惠州 516001)

USP22蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

羅錚錚1，楊小敏2

(1.惠州市中心人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 惠州 516001；2.惠州市第一人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 惠州 516001)

目的探討泛素化特異性蛋白酶22(USP22)在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤和結節性甲狀腺腫中的表達情況，分析其與臨床病理參數的關系。方法應用免疫組織化學方法檢測惠州市中心人民醫院2010-2015年收治的10例結節性甲狀腺腫、20例甲狀腺腺瘤和60例甲狀腺乳頭狀癌組織中USP22蛋白的表達，分析其與性別、年齡、腫物大小、多灶性、包膜浸潤和Ⅵ區淋巴結轉移等臨床病理特征的關系。結果USP22在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達高于甲狀腺腺瘤組織及結節性甲狀腺腫組織，差異有統計學意義(P＜0.05)；USP22的表達與Ⅵ區淋巴結轉移和腫瘤大小有關(P＜0.05)，而與性別、年齡、多灶性、包膜浸潤等特征無關(P＞0.05)。結論與結節性甲狀腺腫和甲狀腺腺瘤相比，USP22在甲狀腺乳頭狀癌組織細胞中高表達，其高表達與腫瘤大小和Ⅵ區淋巴結轉移有關。USP22蛋白可能是一種新的預測甲狀腺乳頭狀癌預后的腫瘤標記物以及生物治療靶點。

甲狀腺乳頭狀癌；泛素化特異性蛋白酶22；Ⅵ區淋巴結轉移；免疫組織化學

甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，在頭頸部惡性腫瘤中占5.11%[1]，在北美，甲狀腺癌的發病率以每年超過6%的速度增長，已成為女性惡性腫瘤的第5位[2]。超過90%的甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)，主要包括甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)和甲狀腺濾泡狀癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)，臨床上以 PTC 最為常見，約占 70%[3]。隨著分子生物學的不斷發展，與甲狀腺癌有關的基因突變分子靶點及相關信號轉導通路正逐漸被人們所認識，這有助于評估甲狀腺癌的惡性程度、侵襲性和轉移風險，以及決定手術切除范圍、Ⅵ區淋巴結的處理等，針對相關異常信號通路和基因突變設計的生物靶向治療正成為一種新的治療甲狀腺癌的方法。泛素化特異性蛋白酶22(ubiquitin specific protease 22，USP22)是近年來新發現的腫瘤標記物，能夠通過去除泛素連接蛋白底物上的泛素調控泛素化的過程，參與細胞內多種蛋白的降解，調控一系列細胞內活動如生長、分化、細胞周期調控、腫瘤的形成、抗原呈遞、轉錄調控及信號轉導等[4]。國內外相關報道已發現，USP22在喉癌、肺癌、口腔鱗癌等多種腫瘤細胞中高表達，且與腫瘤的病理分期、浸潤程度、淋巴結轉移、患者生存率以及不良預后密切相關[5-7]。本研究旨在通過免疫組化染色法檢測USP22在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤及結節性甲狀腺腫中的表達，分析其與腫瘤臨床病理特征的關系，初步探討USP22表達在甲狀腺乳頭狀癌發生發展中的作用，以期為甲狀腺乳頭狀癌的診斷、治療和預測疾病轉歸提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 入組標準：①本院初治患者，在我院行手術治療；②經病理確診為甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤和結節性甲狀腺腫患者；③術前影像學(彩超或CT)及甲狀腺功能等臨床資料完整。排除標準：①有甲狀腺二次或多次手術史；②術前有頭頸部放療史、化療史、碘131治療及生物靶向治療史。

1.2 標本來源 按照以上標準選取2010-2015年惠州市中心人民醫院收治的經手術治療、經病理確診、影像學及甲狀腺功能等臨床資料完整的甲狀腺乳頭狀癌60例。甲狀腺癌中男性14例，女性46例；年齡20～80歲，中位數41歲。按照2010年AJCC甲狀腺癌TNM分期診斷標準，Ⅰ期48例，Ⅱ期0例，Ⅲ期5例，Ⅳ期7例。甲狀腺原發病灶為單一病灶37例，多灶病變23例。原發灶最大直徑0.1～6 cm，平均1.845 cm。所有甲狀腺乳頭狀癌患者均行單葉+峽部切除或雙葉全切或次全切+Ⅵ區淋巴結探查或清掃術。另隨機選取符合入組標準的結節性甲狀腺腫10例、甲狀腺腺瘤20例作為甲狀腺良性結節組(對照組)。

1.3 主要試劑 兔抗人USP22多克隆抗體(產品編號：ab4812，美國Abcam公司)、即用型超敏二步法免疫組化試劑盒(產品編號：PV-9001/PV-9003，北京中杉金橋公司)、DAB顯色試劑盒(產品編號：ZLI-9017，北京中杉金橋公司)。

1.4 檢測方法采用免疫組化法對石蠟切片組織進行檢測。所有組織標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，以厚4～6 μm連續切片，在75℃烤箱中烘烤1～2 h。經脫蠟復水后將切片泡入0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復緩沖液(pH=6)中在微波爐中大火加熱修復15 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗、3%過氧化氫封閉后，滴加USP22一抗工作液(工作濃度為1:100)，室溫靜置1 h后濕盒內4℃孵育過夜。次日滴加適量HRP標記的抗兔二抗，室溫孵育40 min。DAB顯色、蘇木素復染，脫水封片。用已知陽性反應切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 免疫組化結果判定 USP22定位在細胞漿中，呈現棕黃色。免疫組化實驗結果數據采用半定量法，在400×視野下，根據陽性細胞數百分比和染色深度，兩位病理科醫師雙盲獨立計分。陽性細胞數占比：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。陽性細胞的染色深度：不著色或基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。將上述兩項分數相乘得出最終計分：0～1為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性(++)，＞6分為強陽性(+++)。

1.6 統計學方法所有數據應用SPSS19.0軟件進行分析，應用兩獨立樣本比較的非參數秩和檢驗(Wilcoxon秩和檢驗)分析USP22在甲狀腺乳頭狀癌及良性甲狀腺結節組織中的表達是否有統計學差異。應用Wilcoxon秩和檢驗分析USP22與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征(年齡、性別、腫塊大小、多病灶、Ⅵ區淋巴結轉移)的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 USP22在甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺結節中的表達 USP22在甲狀腺濾泡上皮中的表達定位于細胞漿。60例甲狀腺乳頭狀癌組織中，4例陰性表達，15例弱陽性表達，25例中等陽性表達，16例強陽性表達。30例良性甲狀腺結節組織中，8例陰性表達，11例弱陽性表達，9例中等陽性表達，2例強陽性表達。兩樣本Wilcoxon秩和檢驗結果顯示，USP22在甲狀腺乳頭狀癌組與良性甲狀腺結節組的表達強度差異有統計學意義(Z=-3.317，P=0.001＜0.05)，以甲狀腺乳頭狀癌組較強(秩均值51.67＞33.17)，見表1和圖1～6。

表1 USP22在甲狀腺乳頭狀癌、良性甲狀腺結節組織中的表達(例)

圖1 USP22在甲狀腺乳頭狀癌組織中強性表達(×200)

圖2 USP22在甲狀腺乳頭狀癌組織中弱陽性表達(×200)

圖3 USP22在甲狀腺腺瘤組織中強陽性表達(×200)

圖4 USP22在甲狀腺腺瘤組織中弱陽性表達(×200)

圖5 USP22在結節性甲狀腺腫組織中強陽性表達(×200)

2.2 USP22在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與腫瘤臨床病理特征的關系 USP22蛋白陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤多灶性、包膜浸潤無關(P＞0.05)，而與腫瘤大小、Ⅵ區淋巴結是否轉移有關(P＜0.05)，見表2。

圖6 USP22在結節性甲狀腺腫組織中陰性表達(×200)

表2 甲狀腺乳頭狀癌USP22表達與臨床病理特征的關系(例)

3 討 論

甲狀腺結節是內分泌系統的多發病和常見病，近年來發病率逐漸增高。研究發現，在北美，甲狀腺癌的發病率以每年超過6%的速度增長，已成為女性惡性腫瘤的第5位[2]。而在我國，甲狀腺癌發病率以每年14.51%的速度上升，是近20年來女性惡性腫瘤中增長速度最快的腫瘤之一[8]。早期發現并明確甲狀腺結節的性質，可對疾病進行早期干預，且可避免不必要的手術治療，以及對疾病預后進行評估。

在術前評估甲狀腺結節性質時，細針穿刺抽吸活組織檢查(fine needle aspiration biospy，FNAB)是靈敏度和特異性最高的方法。對于FNAB難以明確診斷的甲狀腺結節，應用免疫組織化學技術檢測腫瘤分子標記物并結合FNAB進行病理診斷，可提高術前診斷的準確性[9-10]。選擇合適的免疫組化標記抗體在術前評估腫瘤的惡性程度、浸潤侵襲性和預后，對于指導臨床決定手術方式以及術后進一步治療有著重要的意義[11]。

USP22是近年來新發現的腫瘤標記物，由Glinsky等[12]于2005年首次發現，屬于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)家族成員以及癌死亡標記(death-from-cancer signature)基因組成員。人類USP22基因定位于17號染色體，已發現編碼氨基酸525個及泛素特異性加工酶(ubiquitin-specifice processing enzymess，UBPs)中去泛素化酶的特定區域，通過泛素介導蛋白酶體途徑(ubiquitin-mediated proteasomal pathway)參與細胞內多種蛋白的降解，并調控一系列細胞內活動如細胞生長分化、細胞周期調控、抗原呈遞、轉錄調控及信號轉導等。USP22基因已被發現在人體多個組織器官中有表達，如心肌、骨骼肌、肝、肺等，在原始胚胎組織中也有表達，如神經系統組織、生殖腺組織、肝細胞、骨髓細胞等[4]。

研究發現，USP22能夠激活c-Myc的轉錄，影響細胞周期的進程[13]。此外，USP22可通過局部黏著斑酶(focal adhesion kinase，FAK)信號通路和去泛素化上皮間質轉化因子TGF-β通路促進上皮間質轉化，這與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關[14]。另外，USP22還可去泛素化端粒重復序列連接因子1(telomeric-repeat-binding factor 1，TRF1)，其活性可影響TRF1的穩定性，參與端粒的維持[15]。上述研究結論都表明，USP22的表達在腫瘤細胞增殖、生長的過程中起到了促進作用。

目前已發現USP22在非小細胞肺癌、口腔鱗癌、喉癌等多種腫瘤細胞中高表達，且與腫瘤的病理分期、浸潤程度、淋巴結轉移、患者生存率以及不良預后密切相關。故USP22可作用一種重要的腫瘤標記物，在臨床上可作為評估惡性腫瘤惡性程度、浸潤侵襲、不良預后的重要指標。若應用于術前穿刺細胞學檢測，可進一步提高病理診斷的準確性，以幫助臨床醫生更準確地制定下一步治療方案。

本實驗應用免疫組化法對60例甲狀腺乳頭狀癌、20例甲狀腺腺瘤以及10例結節性甲狀腺腫中USP22蛋白的表達進行檢測。結果顯示，USP22在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達陽性率明顯高于甲狀腺腺瘤和結節性甲狀腺腫組織，差異具有統計學意義(P＜0.05)，說明USP22可能參與了甲狀腺癌發生發展的過程，這與其在其他腫瘤組織中的表達情況一致。

再進一步分析USP22表達與甲狀腺乳頭狀癌各項臨床病理特征的關系，結果顯示，USP22在有Ⅵ區淋巴結轉移的甲狀腺癌病例中的表達明顯高于無Ⅵ區淋巴結轉移的病例，差異具有統計學意義(P=0.028)，在腫瘤最大直徑≥2 cm的病例中的表達明顯高于腫瘤最大直徑＜2 cm的病例，差異具有統計學意義(P=0.006)，而與年齡、性別、多病灶、包膜浸潤無關。腫瘤大小體現了腫瘤細胞的增殖能力和速度，淋巴結轉移體現了腫瘤細胞失去細胞間黏附、突破包膜向外侵襲、擴散的能力，上述實驗結果表明USP22可能有增強甲狀腺癌細胞增殖及局部浸潤擴散能力的作用。研究表明，Ⅵ區淋巴結轉移是甲狀腺癌重要的預后因素[16]，此外，鄢丹桂[17]還綜合比較了歐洲甲狀腺癌協作組、俄亥俄州州立大學、美國紐約紀念Sloan-Kettering癌癥中心、全美甲狀腺癌協作治療研究組等甲狀腺癌研究中心的分化型甲狀腺癌預后評分指標，結果顯示大部分研究組均把腫瘤大小納入預后評分系統中。故本實驗結果表明USP22可能有增強甲狀腺癌細胞增殖及局部浸潤擴散能力的作用。

然而，由于甲狀腺乳頭狀癌的術后預后相對良好，本文未對USP22的表達與甲狀腺癌術后的預后關系進行研究，具有一定的局限性。此外，由于甲狀腺濾泡性癌、髓樣癌以及未分化癌的發病率相對較少，本文亦未做單獨統計和討論，該課題仍有進一步研究的空間。

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Expression of USP22 protein in thyroid papillary carcinoma and and its clinical significance.

LUO Zheng-zheng1, YANG Xiao-min2.1.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Huizhou Municipal Central Hospital,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA;2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Huizhou No.1 People Hospital,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of ubiquitin specific protease 22(USP22)in human thyroid papillary carcinoma,thyroid adenoma and nodular goiter,and to analyze its relationship with the clinical pathologic characteristics(gender,age,tumor size,multifocal,central lymph node metastasis).MethodsThe expression of USP22 protein was detected by immunohistochemistry in 10 cases of nodular goiter,20 cases of thyroid adenoma and 60 cases of thyroid papillay carcinoma in Huizhou Municipal Central Hospital from 2010 to 2015.The clinical pathologic factors(gender,age,tumor size,multifocality,extracapsular invasion and central lymph node metastasis)were collected,and the correlation between the expression of USP22 protein and various clinicopathologic factors were analyzed.ResultsThe expression level of USP22 protein in thyroid papillary carcinoma tissues was significantly higher than that in thyroid adenoma or nodular goiter(P＜0.05).The expression of USP22 protein had close correlation with tumor size and central lymph node metastasis(P＜0.05),and had no association with gender,age,multifocality and extracapsular invasion(P＞0.05).ConclusionCompared with nodular goiter and thyroid adenoma,the expression level of USP22 in thyroid papillary carcinoma is significantly higher,and the expression of USP22 protein has close correlation with tumor size and central lymph node metastasis in thyroid papillary carcinoma,which shows that USP22 may be involved in the occurrence and development of thyroid papillary carcinoma,and may be served as a new tumor marker and therapeutic target of thyroid carcinoma.

Thyroid papillary carcinoma;Ubiquitin specific protease 22(USP22);Central lymph node metastasis;Immunohistochemistry

R736.1

A

1003—6350（2017）23—3836—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.017

楊小敏。E-mail：hzyxm01@163.com

2017-04-11)