S100A4蛋白及ZEB1蛋白表達水平與胃癌侵襲轉移及預后的關系

胡陽，劉博，歐陽文，麻繼臣，宋新梅，董魁星

(1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院干部病房一區，河北 石家莊 050000；2.保定市第二醫院腫瘤內科，河北 保定 071051)

S100A4蛋白及ZEB1蛋白表達水平與胃癌侵襲轉移及預后的關系

胡陽1，劉博2，歐陽文1，麻繼臣1，宋新梅2，董魁星1

(1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院干部病房一區，河北 石家莊 050000；2.保定市第二醫院腫瘤內科，河北 保定 071051)

目的探討S100A4蛋白及ZEB1蛋白表達水平與胃癌侵襲轉移及預后的關系。方法選取中國人民解放軍白求恩國際和平醫院2013年5月至2015年5月接診的胃癌患者68例，采用HE染色技術對采集的胃組織標本進行病理學確診；采用免疫組織染色法檢測胃癌組織、癌旁正常組織及腺瘤樣異型增生、慢性胃炎、胃黏膜腸上皮化生組織標本中S100A4的及ZEB1蛋白表達水平，分析兩種蛋白的表達與胃癌侵襲轉移及預后的關系。結果S100A4的表達水平分析顯示，胃癌(55.9%)＞腺瘤樣異型增生(36.4%)＞腸上皮化生(20.0%)＞慢性胃炎(15.4%)＞癌旁正常組織(7.4%)。ZEB1的表達水平分析顯示，胃癌(82.4%)＞腺瘤樣異型增生(45.5%)＞慢性胃炎(30.8%)＞腸上皮化生(26.7%)＞癌旁正常組織(23.5%)；組間比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。患者的年齡和性別與S100A4表達無明顯相關，S100A4在胃癌組織中的表達水平與侵襲深度、淋巴結轉移、腫瘤大小、腫瘤TNM分期呈正相關，差異具有統計學意義(P＜0.05)。胃癌組織分化程度、腫瘤大小、年齡、性別與胃癌組織中ZEB1的表達均無明顯相關(P＞0.05)。胃癌侵襲較深、存在淋巴結轉移、腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ時，胃癌組織中的ZEB1表達陽性率較高(P＜0.05)。結論S100A4及ZEB1過度表達，腫瘤浸潤深度，淋巴結轉移，靜脈浸潤，淋巴管浸潤和TNM分期可作為胃癌患者不良預后的獨立預測指標。

S100A4蛋白；ZEB1蛋白；胃癌；侵襲；轉移；預后

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，死亡率極高，僅次于肺癌[1]。胃癌發病后病情進展較快，且容易發生侵襲轉移造成患者術后病情復發，大多數的胃癌患者預后較差[2]。研究表明，惡性腫瘤的侵襲和轉移涉及體內多種信號傳導通路以及多個基因表達與分子調控的復雜過程[3]。相關研究表明，S100A4蛋白通過調控細胞間黏附、細胞周期進程和相關的腫瘤轉錄因子表達進而影響到腫瘤的侵襲轉移和預后[4-5]。ZEB1是一種E盒結合鋅指蛋白，能夠促進上皮-間質轉化(epithelial-meseiichymal transition，EMT)并且誘導基質金屬蛋白酶的表達，對腫瘤細胞侵襲和轉移具有明顯的促進作用，在多種惡性腫瘤組織中均有表達[6]。本文旨在探討S100A4和ZEB1的表達與胃癌細胞侵襲和轉移以及患者預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2015年5月中國人民解放軍白求恩國際和平醫院收治的68例胃癌患者的175例胃組織標本為研究對象，其中胃手術切除組織標本：胃癌組織標本(68例)，癌旁正常組織標本(68例)；內鏡活檢組織標本：腺瘤樣異型增生(11例)，慢性胃炎(13例)，胃黏膜腸上皮化生(15例)。經確認所有患者術前均未進行放療或化療。根據國際抗癌聯盟(Union Internationale Contre le Cancer，UICC)標準對胃癌標本進行TNM分期，應用HE染色、EVG染色和D2-40免疫染色對胃癌細胞侵襲靜脈及淋巴管情況進行評定。患者出院后進行為期6個月的電話跟蹤隨訪，并統計患者門診復查結果進行預后分析。研究取得患者同意，簽訂知情同意書，經醫院倫理委員會通過。

1.2方法免疫組化檢測：采用EnVision方法對胃癌及其癌前病變組織進行免疫組化染色。兔抗人S100A4多克隆抗體(海陽光試劑有限公司)。小鼠抗人ZEB1單克隆抗體(上海艾躍生物科技有限公司—Active motif中國)，DAB顯色試劑盒、SP試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。所有檢測試驗操作均嚴格按照試劑盒的說明書進行。陰性對照[磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，pH7.4，0.01 mol/L]。對患者病理組織切片進行免疫組化染色，依據結果判定患者的S100A4及ZEB1表達情況：邀請兩名臨床經驗豐富的病理科醫師作為評定專家(評定專家未接觸患者的臨床資料)，遵循隨機原則，將免疫組化切片隨機分配，顯微鏡下放大200倍觀察S100A4陽性細胞數和ZEB1陽性細胞數，并進行組間比較。檢測陽性判斷標準：細胞質內可見黃色顆粒分布則判定為陽性；檢測標準：組織細胞染色，為 0～5%，記為(-)；染色細胞數6%～25%為弱陽性，記為(+)；染色細胞數25%～50%為中陽性記(++)，超過一半的細胞染色為強陽性，記為(+++)。

1.3 統計學方法所有數據采用SPSS20.0統計軟件進行分析，計數資料以例(%)表示，統計分析采用χ2檢驗；計量資料的統計描述用均數±標準差(x-±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較行方差分析(F檢驗)，組內比較采用配對資料t檢驗。多因素分析采用Logistics回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化分析S100A4及ZEB1的表達 免疫組化染色結果表明，S100A4及ZEB1蛋白陽性表達主要定位于細胞核中，呈棕黃色顆粒。S100A4及ZEB1蛋白的表達按以下順序逐漸減少：胃癌＞腺瘤樣異型增生＞腸上皮化生＞慢性胃炎＞癌旁正常組織，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 S100A4及ZEB1的表達情況[例(%)]

2.2 S100A4及ZEB1表達與臨床病理學特點的關系 患者的年齡和性別與S100A4表達無明顯相關性(P＞0.05)，S100A4在胃癌組織中的表達水平與侵襲深度、淋巴結轉移、腫瘤大小、腫瘤TNM分期呈正相關，差異具有統計學意義(P＜0.05)。S100A4基因表達在腸型(IT)胃癌高于彌漫型(DT)癌，差異具有統計學意義(P＜0.001)，見表2。性別、腫瘤直徑和胃癌組織分化均與胃癌組織中ZEB1的表達無關(P＞0.05)，而浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤TNM分期與胃癌組織中ZEB1的表達相關，差異具有統計學意義(P＜0.05)。當胃癌浸潤深度較深、伴有淋巴結轉移、伴有遠處轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ時，胃癌組織中的ZEB1表達陽性率較高(P＜0.05)，分別為92.9%、90.6%、91.7%、90.9%。提示ZEB1的表達可能與胃癌的轉移、侵襲及進展有關，見表3。

表2 胃癌組織中S100A4與臨床病理學特點的關系(例)

表3 ZEB1表達與臨床病理學特點的關系(例)

2.3 多因素分析S100A4及ZEB1表達與胃癌患者生存的關系 對68例胃癌患者進行為期6個月的隨訪。多因素分析采用Cox比例模型來確定各種臨床病理參數的獨立預后作用。研究結果表明，浸潤深度，淋巴管及靜脈浸潤，淋巴結轉移，TNM分期與S100A4及ZEB1表達均是胃癌的預后不良的獨立因素(P＜0.05)，見表4。

表4 S100A4及ZEB1表達與胃癌患者生存的關系

3 討 論

上皮-間質轉化(EMT)對于多細胞生物發育過程具有重要意義，是指上皮細胞到間質細胞轉化這一基礎過程，它賦予細胞轉移和入侵的能力，能夠減少凋亡與衰老，促進免疫抑制。但EMT同樣參與機體氣管纖維化、組織愈合、慢性炎癥以及癌癥等過程。在乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌以及鼻咽癌等上皮來源的惡性腫瘤組織中，EMT誘導基因調控，上皮細胞失去細胞極性和細胞連接，組織松散，運動能力增強，因而容易從腫瘤的原發病灶遷移到鄰近的組織器官中，具備了腫瘤細胞浸潤和遠處轉移的條件[8]。目前，研究已證實，EMT為惡性腫瘤細胞侵襲轉移的重要生理基礎[9]。

S100屬于轉移相關性基因，S100A4基因調控AKT/Slug通路并且抑制E-cadherin蛋白表達，調控細胞間黏附、細胞周期進程和相關的腫瘤轉錄因子表達進而影響到食管癌患者腫瘤的侵襲轉移和預后[10]。近年來，Chen等[11]學者陸續發現S100A4過度表達，對p53相關基因進行調控，然后與突變型p53蛋白鰲合，抑制p53蛋白對腫瘤細胞凋亡作用，而抑制S100A4基因在體內進行表達時，能夠明顯抑制BGC823癌變細胞的增殖，促進癌變細胞的凋亡。ZEB1是一種E盒結合鋅指蛋白，能夠促進上皮-間質轉化(epithelial-meseiichymal transition，EMT)并且誘導基質金屬蛋白酶的表達，對腫瘤細胞侵襲和轉移具有明顯的促進作用，在多種惡性腫瘤組織中均有表達。臨床研究表明，ZEB1能夠在mRNA水平抑制卵巢癌、口腔鱗狀細胞癌、胰腺癌等多種惡心腫瘤細胞E-cadherin蛋白表達，同時促進EMT進程，導致癌變細胞遷移和擴散[12]。ZEB1在肺癌組織中高度表達與肺癌患者淋巴結浸潤、淋巴結轉移以及患者的預后不良密切相關。

本研究中，研究結果顯示S100A4基因在胃癌組織中的表達與患者預后呈負相關，這與以前的報道相一致。Cox比例風險回歸模型分析結果表明，胃癌組織中的S100A4表達、靜脈侵襲或淋巴管侵襲、淋巴管轉移、浸潤深度以及TNM分期均為胃癌患者預后不良的獨立因素。國外學者對C期結腸癌患者病理切片進行免疫組化染色檢測發現，細胞核未發現S100A4的染色，僅細胞質出現染色，且S100A4的過度表達與患者的預后狀況呈負相關[13]。Kang等[14]發現S100A4過度表達是大腸癌患者不良預后的獨立預測指標。近年來，國內外研究均發現類似的結果在膀胱癌、胰腺癌、咽喉癌患者中均存在[15]。S100A4基因上調腫瘤生長因子-β通路，同時促進基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，促使細胞外基質降解，抑制E-鈣結合蛋白表達，使癌變細胞黏附較小，喪失細胞極性，發生鄰近組織侵襲和遠處轉移。上述這些研究發現均表明，S100A4基因表達是胃癌患者的不良預后的獨立預測指標。

本文通過免疫組化染色檢測并分析比較胃癌組織與癌旁正常組織中ZEB1的表達差異，結果顯示胃癌組織中ZEB1在的陽性表達率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織中的ZEB1表達陽性率，提示ZEB1為癌變相關基因，當其在胃癌組織中過度表達時，對腫瘤細胞侵襲和轉移具有明顯的促進作用，誘導病情進一步惡化，導致患者預后不良。通過將ZEB1表達情況結合胃癌臨床病理特征進行Logistic二元線性回歸分析，結果顯示ZEB1陽性表達率與胃癌患者的胃癌的組織分化程度、腫瘤大小、年齡、性別均無關，而胃癌侵襲較深、存在淋巴結轉移、腫瘤TNM分期較晚時，胃癌組織中的ZEB1表達陽性率較高(P＜0.05)。明顯高于浸潤較前、無淋巴結轉移及TNM分期較早的患者，提示胃癌組織浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤TNM分期與胃癌組織中ZEB1的表達密切相關。ZEB1在胃癌組織中過度表達促進上皮-間質轉化，調控E-cadherin蛋白表達下降，導致細胞極性缺失獲得遷移能力，促進腫瘤侵襲和轉移參了對腫瘤細胞調亡、細胞周期及復制衰老等方面的調控，參與病情的進展。

S100A4及ZEB1在胃癌組織中過表達與胃癌侵襲、淋巴結轉移、腫瘤大小和患者的不良預后密切相關，檢測胃癌組織中S100A4及ZEB1表達情況有助于對胃癌惡性程度的臨床判斷并為治療提供依據。

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Relationship between the expression of S100A4 protein,ZEB1 protein and invasion,metastasis,prognosis of gastric cancer.

HU Yang1,LIU Bo2,OUYANG Wen1,MA Ji-chen1,SONG Xin-mei2,DONG Kui-xing1.1.Cadre Ward, Bethune International Peace Hospital of the People's Liberation Army,Shijiazhuang 050000,Hebei,CHINA;2.Department of Internal Medicine-Oncology,the Second Hospital of Baoding,Baoding 071051,Hebei,CHINA

ObjectiveTo explore relationship between the expression of S100A4 protein,ZEB1 protein and invasion,metastasis,prognosis of gastric cancer.MethodsA total of 68 patients with gastric cancer were selected in Bethune International Peace Hospital of the People's Liberation Army from May 2013 to May 2015.HE staining technique was used to diagnose the gastric tissue samples.Immunohistochemical staining was used to detect the expression level of S100A4 protein,ZEB1 protein in gastric cancer tissues,normal tissues and adenomatous dysplasia,chronic gastritis,intestinal metaplasia of gastric mucosa.Relationships between the expression of S100A4 protein,ZEB1 protein and invasion,metastasis,prognosis of gastric cancer were analyzed.ResultsThe expression levels of S100A4 were decreased successively in gastric cancer(55.9%),adenomatous dysplasia(36.4%),intestinal metaplasia(20.0%),chronic gastritis(15.4%),and adjacent normal tissue(7.4%).The levels of ZEB1 from high to low were in gastric cancer(82.4%),adenomatous dysplasia(45.5%),chronic gastritis(30.8%),intestinal metaplasia(26.7%),and adjacent normal tissue(23.5%).The differences between groups were statistically significant(P＜0.05).There was no significant correlation between expression of S100A4 in gastric cancer and age,sex(P＞0.05),while S100A4 levels in gastric cancer were correlated withdepth of tumor invasion,lymph node metastasis,tumor size,tumor TNM staging(P＞0.05).There was no significant correlation between expression of ZEB1 in gastric cancer and tumor differentiation degree,tumor size,age and sex(P＞0.05).The positive expression rates of ZEB1 in gastric cancer were higher in patients with deeper gastric cancer invasion,lymph node metastasis,tumor TNM stage ofⅢ～Ⅳ (P＜0.05).ConclusionOverexpression of S100A4 and ZEB1,depth of tumor invasion,lymph node metastasis,venous invasion,lymphatic invasion and TNM staging can be the independent predictors of adverse outcomes in patients with gastric cancer.

胡陽。E-mail：dvdrc58@163.com

S100A4 protein;ZEB1 protein;Gastric cancer;Invasion;Metastasis;Prognosis

R735.2

A

1003—6350（2017）23—3832—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.016

2016-07-25)