SNAI2在結直腸癌中的表達及其對細胞增殖和侵襲能力的影響

鄒永平，李龍鶴

(海南省人民醫院急診外科，海南 海口 570311)

SNAI2在結直腸癌中的表達及其對細胞增殖和侵襲能力的影響

鄒永平，李龍鶴

(海南省人民醫院急診外科，海南 海口 570311)

目的明確鋅指轉錄因子2(SNAI2)在結直腸癌組織中的表達及對結直腸癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法收集海南省人民醫院胃腸外科2015年9月至2016年4月間收治的50例臨床結直腸癌組織樣本及癌旁組織，使用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測其中SNAI2的表達水平，t檢驗比較兩組SNAI2水平的差異。針對SNAI2基因，設計四組干擾RNA序列和一組無任何靶向位點的隨機插入序列。將各組序列剪切到慢病毒載體上，用二代包裝系統包裝成慢病毒懸液。將HT29接種至6孔板，分別標記為對照組、shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組。對照組注入插入隨機序列載體的慢病毒懸液，shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組分別注入插入四組干擾RNA序列的慢病毒懸液。挑選SNAI2表達最高的SW480細胞系進行慢病毒感染，獲得穩定knock-down SNAI2細胞系。在高表達SNAI2的SW480細胞系中，采用慢病毒感染的方法構建穩定干擾SNAI2細胞株。通過噻唑藍(MTS)比色法檢測細胞增殖能力，劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力。同時Western blot檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表達。結果癌旁組織SNAI2的表達量低于結直腸癌組織，差異有統計學意義(P＜0.05)；與對照組比較，細胞黏附分子E-cadherin表達量升高，細胞骨架蛋白、Vimentin表達量降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)；siSNAI2的SW480細胞系中，與對照組比較，細胞增殖能力、侵襲能力顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論SNAI2在人結直腸癌中表達量升高，作為一種癌基因，其可促進結直腸癌細胞的體外增殖、侵襲和體內轉移能力。

SNAI2；結直腸癌；細胞增殖；細胞侵襲

結直腸癌(carcinoma of colon and rectum)是全世界常見的惡性腫瘤之一，在中國，其人群發病率位居第五，且呈逐年上升的趨勢，嚴重威脅著人類的健康[1]。近年來許多研究顯示，鋅指轉錄因子2(SNAI2)在多種惡性腫瘤形成的過程中起到重要的作用：它參與腫瘤干細胞的形成，并在腫瘤的發生發展中發揮促進作用[2]。本研究擬探討SNAI2在結直腸癌細胞中的表達水平及其對結直腸癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本來源 樣本收集于海南省人民醫院胃腸外科2015年9月至2016年4月間大腸癌病理標本50例，以及相應癌旁組織50例(距癌變邊緣15 cm切取)取材后液氮保存。

1.2 細胞來源 實驗所用的人結直腸癌細胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8細胞均來自中國醫學科學院研究中心。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養基(Hyclone)、DMEM培養基(Hyclone)、胎牛血清(Hyclone)、逆轉錄試 劑 盒 (Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas)、定 量 PCR試 劑 盒(iQ SYBR Green Supermix，BioRad)、RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code No.9108)、細胞增殖能力檢測試劑盒(MTS，Promega)、BCAAssay Reagent(美國Pierce Chemical公司)、PVDF膜(Millpore公司，Cat NO.IPVH00010)。

1.4 主要抗體 SNAI2抗體(Abcam，ab27568)、E-cadherin抗體(Abcam，ab15148)、Vimentin抗體(Abcam，ab92547)、β-actin抗體(Santa Cruz，sc-4778)。

1.5 RT-PCR檢測SNAI2基因的表達 TRIZOL法抽提細胞總RNA。紫外分光光度儀檢測RNA濃度，取5 μg RNA進行逆轉錄反應，采用Cyber Green熒光實時定量PCR反應體系檢測基因表達水平。反應條件：預變性94℃ 4 min，擴增條件94℃ 30 s，60℃1 min，40個循環。SNAI2上游引物：5'-AGACCCGCTGGCAAGGTGA CGCAAT-3'；SNAI2下游引物：5'-AATGCTTATTATGCA TCTGAAGT-3'；擴增引物大小為1 308 bp。以β-actin為內參基因，其上游引物序列為5'-TGGCACCCAGCACA ATGAA-3'；下游引物序列為5'-CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA-3'；目的片段大小為186 bp。

1.6 Western-blot檢測 SNAI2、E-cadherin以及Vimentin表達水平 收集結直腸癌癌細胞，裂解液冰上裂解1 h，15 000 g，15 min離心后提取上清液，收集蛋白質，BCA法行蛋白定量分析，配制10%丙烯酰胺膠，上樣，80 V穩壓跑膠30 min，120 V穩壓跑膠1 h，濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.0 h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1.5 h，發光液曝光顯影。一抗濃度比為1：1 000，二抗濃度比為1：3 000，以β-actin作為內參。

1.7 慢病毒轉染構建穩定knock-down SNAI2細胞系 針對SNAI2基因設計四組干擾RNA序列和一組無任何靶向位點的隨機插入序列。將各組序列剪切到慢病毒載體上，用二代包裝系統包裝成慢病毒懸液。將HT29接種至6孔板，分別標記為對照組、shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組。對照組注入插入隨機序列載體的慢病毒懸液，shSNAI2 1#組、shSNAI2 2#組#、shSNAI2 3#組、shSNAI2 4#組分別注入插入四組干擾RNA序列的慢病毒懸液。挑選SNAI2表達最高的SW480細胞系進行慢病毒感染，獲得穩定knock-down SNAI2細胞系。具體方法：用Lipofectamine 2000以2.5:1的體積比將慢病毒shRNA質粒(6 μg/dish)、packing質粒(psPAX2，4.5 μg/dish)和Envelop質粒(pMD2.G；1.5 μg/dish)一并轉入293T細胞，7 h后更換正常培基，培養48 h，過濾收集上清液，并將帶有慢病毒的上清液感染SW480細胞，感染3 d后(加入Polybrene)，使用Puromycin篩選穩定細胞系，并進行Western blot驗證。有效shRNA序列為shSNAI21#：TTCACAGCTGTCCCAGAGGG；shSNAI2 2#：TGAGGCGGGACCCTCAGGCC；shCtrl：GCTGTTT TTTGAGATTTCAG，詳細步驟參見文獻[3]。

1.8 MTS法檢測細胞增殖活力 收集對數生長期細胞，以5×103個細胞每孔的細胞濃度，將細胞接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液(設置5個復孔)，置于5%CO2、37℃培養箱中培養。分別檢測細胞0 h、24 h、48 h以及72 h的細胞增殖活力，MTS與培基以1:5的比例混合均勻，混勻后于生化培養箱中孵育60 min后用多孔板酶標儀在490 nm檢測吸光度。

1.9 細胞侵襲實驗以及細胞劃痕修復實驗 采用Transwell小孔遷移試驗檢測細胞的侵襲能力，具體步驟見參見文獻[3]及說明書。

1.10 統計學方法應用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RT-PCR檢測臨床樣本中SNAI2 mRNA的表達 RT-PCR結果顯示，結直腸癌組織細胞中SNAI2 mRNA水平相比正常癌旁組織顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

2.2 Western blot檢測直腸癌細胞系中SNAI2的表達 在 HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8細胞系中檢測SNAI2蛋白的表達水平，選取表達量最高的細胞系構建穩定knock-down SNAI2細胞系。結果顯示，SW480細胞系SNAI2表達量高于其他細胞系，見圖2。

圖1 SNAI2在結腸癌組織和正常癌旁組織中的mRNA表達水平比較

圖2 SNAI2在結腸癌細胞系中的蛋白表達水平及比較

2.3 五組SNAI2蛋白及mRNA的表達量比較 Western blot法檢測SNAI2蛋白表達量，結果顯示，shSNAI2 1#組、shSNAI2 3#組SNAI2蛋白水平下調顯著，與對照組相比，差異均有統計學意義(P＜0.05)；RT-PCR 法檢測顯示，shSNAI2 1#組、shSNAI2 3#組SNAI2 mRNA表達明顯下調，與對照組相比，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖3和圖4。

2.4 干擾SNAI2表達對SW480細胞增殖能力的影響 利用MTS方法檢測敲除SNAI2后，SW480細胞增殖活力的變化。MTS法連續檢測3 d對照組及knock-down SNAI2穩定細胞系中的細胞增殖活力改變，在經過慢病毒感染后的穩定knock-down SNAI2細胞中，細胞在第2天、第3天細胞增殖活力明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 SW480 knock-down SNAI2細胞系4組序列的蛋白表達水平

圖4 SW480 knock-down SNAI2細胞系4組序列的mRNA表達水平

圖5 SW480 knock-down SNAI2細胞系MTS增殖活力的變化

2.5 干擾SNAI2表達對SW480細胞遷移能力的影響 對shSNAI2的SW480細胞系進行細胞劃痕修復實驗。在劃痕0 h及24 h兩個時間點進行拍照，比較兩組細胞的遷移能力。結果顯示，與對照組比較，shSNAI2的SW480細胞系細胞遷移能力減弱，見圖6。

圖6 SW480細胞knock-down SNAI2細胞系劃痕修復實驗比較

2.6 干擾SNAI2表達水平對SW480細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平的影響 上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關分子：E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達水平可作為評價腫瘤細胞侵襲轉移的標志性特征。利用Western blot檢測E-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平。從結果可以看出，SNAI2下調后，E-cadherin的表達顯著上調，Vimentin表達降低，見圖7。

圖7 SW480細胞knock-down SNAI2細胞系E-cadherin和Vimentin蛋白的表達量

3 討 論

SNAI2在人正常機體內充當調節激活轉錄的作用，并參與神經嵴細胞的產生和遷移[4]。近年來有許多報道顯示，其與多種腫瘤的發生發展密切相關：SNAI2參與抑制緊密連接蛋白(Zo-1)的表達，促進上皮細胞惡性轉化[5]。Tripathi等[6]研究發現，乳腺細胞中，SNAI2通過結合E2-BOX蛋白和募集羧基末端結合蛋白-1(C-terminal-binding protein-1，CTBP1)及組蛋白去乙?；?(histone deacetylase-1，HDAC1)，調控乳腺癌相關基因BRCA2的表達。Wang等[7]和Gu等[8]研究證明，在卵巢癌細胞中，SNAI2可通過抑制Aurora-A的表達來促進細胞的侵襲及轉移。在肝癌細胞中，SNAI2可促進轉錄因子SOX2及Nanog的表達，促進肝癌細胞的侵襲和轉移[9]，對TWIST1誘導的EMT及其促進侵襲轉移能力也起到重要作用[10]。

本研究運用熒光定量PCR技術檢測結直腸癌樣本及癌旁正常組織中SNAI2的mRNA表達水平，發現結直腸癌組織中SNAI2的mRNA表達明顯高于正常癌旁組織，提示高表達的SNAI2在癌癥發生發展的過程中可能起一定的作用進而我們通過慢病毒轉染shRNA SNAI2質粒構建穩定敲除SNAI2的SW480細胞系。MTS的結果發現SNAI2表達下調后，腫瘤細胞增殖能力顯著降低，表明SNAI2在結直腸癌中能促進腫瘤細胞的增殖。劃痕修復實驗結果示SNAI2下調后，細胞遷移能力顯著減弱，表明SNAI2在結直腸癌中能促進腫瘤細胞的遷移。經進一步對shSNAI2 SW480細胞系的EMT相關分子E-cadherin及Vimentin進行檢測，結果顯示，E-cadherin是上皮細胞表達的一種重要的黏附分子，代表細胞的黏附強度，惡變過程中E-cadherin的表達下調往往意味著細胞活動性增加，腫瘤細胞轉移能力增強；Vimentin是構成細胞骨架的重要成分，在細胞移行、黏附中起關鍵作用。有許多研究指出Vimentin在惡性腫瘤中表達增強且與細胞侵襲轉移正相關[11]。本實驗中，下調SNAI2后，E-cadherin表達上調，Vimentin表達下調，提示SNAI2在結直腸癌侵襲轉移中起到促進作用。

綜上所述，SNAI2對結直腸癌的發生發展有著積極的作用。在接下來的研究中，將進一步通過動物體內實驗驗證SNAI2在腫瘤發生發展中的作用，并結合臨床標本，分析臨床資料，闡明SNAI2在結直腸癌患者的預后以及復發和轉移中的確切作用，SNAI2在腫瘤發生侵襲轉移的早期和后期分別扮演著何種角色，確定其可能的靶標分子，為結直腸癌的臨床診治以及診斷提供一個新的分子靶標。

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Expression of SNAI2 in colorectal cancer and its effect on cell proliferation and invasion.

ZOU Yong-ping,LI Long-he.Department of Emergency Surgery,Hainan General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo define the expression of SNAI2 in colorectal cancer and its effect on the proliferation and invasion of colorectal cancer cells.MethodsThe expression level of SNAI2 was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)in 50 cases of colorectal cancer tissues and adjacent tissues from Department of Gastrointestinal Surgery in our hospital during Sep.2015 and Apr.2016,and the difference between the two groups was detected by t test.For the SNAI2 gene,four groups of interfering RNA sequences and a group of random insertion sequences without any targeting sites were designed.The sequence of each group was sheared onto lentiviral vector and packaged into lentivirus suspension by two generation packaging system.HT29 was inoculated into 6 orifice plates and labeled as control group,shSNAI2 1#group,shSNAI2 2#group,shSNAI2 3#group,and shSNAI2 4#group.The control group was injected with lentivirus suspension inserted into the random sequence vector.ShSNAI2 1#group,shSNAI2 2#group,shSNAI2 3#group and shSNAI2 4#group were injected with four groups of lentivirus suspension which interfered with RNA sequence.SNAI2 cell line with the highest expression of SW480 was selected for lentivirus infection,and stable knock-down SNAI2 cell line was obtained.In SW480 cells with the high expression of SNAI2,the SNAI2 interference of stable cell lines was established through slow infection.The proliferation ability of cell was detected by thiazole blue(MTS)colorimetry method.The cell invasion ability was detected by scarification test.Western blot was used to detect the expression of E-cadherin and Vimentin.ResultsThe expression of SNAI2 in normal adjacent tissues was less than that in colorectal cancer tissues compared with normal adjacent tissues,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The expression of cell adhesion molecule E-cadherin increased compared with the control group,while the expression of cytoskeletal protein and Vimentin decreased,both with statistically significant difference(P＜0.05).In

2014年海南省應用技術研發與示范推廣專項(編號：ZDXM2014066)

鄒永平。E-mail：strong007@qq.com the SW480 siSNAI2 cell line,compared with the control group,the cell invasion and proliferation ability decreased significantly(P＜0.05).ConclusionSNAI2 is highly expressed in human colorectal cancer tissue,and it could promote the proliferation,invasion and migration of colorectal cancer cells in vivo.

SNAI2;Colorectal cancer;Cell proliferation;Cell invasion

R735

A

1003—6350（2017）23—3789—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.002

2017-07-07)